清華新聞網(wǎng)1月19日電 CRISPR-Cas系統(tǒng)作為細(xì)菌、古細(xì)菌以及巨噬菌體抵抗外源核酸入侵的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)生物學(xué)研究、農(nóng)業(yè)育種、人類(lèi)疾病治療以及體外核酸檢測(cè)等方面。近年來(lái)的研究根據(jù)Cas核酸酶的種類(lèi)將CRISPR-Cas系統(tǒng)具體分為2個(gè)大類(lèi)，6個(gè)亞型，其中V型Cas12系統(tǒng)的種類(lèi)和功能最為豐富多樣且存在多種較小分子尺寸的核酸酶系統(tǒng)，如CasX(Cas12e）、Cas14(Cas12f）、CasΦ(Cas12j）以及Cas12i等。盡管研究者通過(guò)理性設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化等方法提升了這些系統(tǒng)的基因編輯效率，但是目前已經(jīng)鑒定的Cas12蛋白只能識(shí)別富含T的PAM (T-rich PAM)，這嚴(yán)重阻礙了Cas12家族的體內(nèi)基因編輯以及體外臨床檢測(cè)等的應(yīng)用。
清華大學(xué)生命學(xué)院助理教授劉俊杰課題組長(zhǎng)期關(guān)注DNA和RNA核酸酶研究及相關(guān)核酸操縱工具的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。近年來(lái)，劉俊杰及其合作者發(fā)現(xiàn)并鑒定了一類(lèi)可用于基因編輯操作、識(shí)別T-richPAM的小型CasX核酸酶（Nature，2019），并通過(guò)蛋白質(zhì)和sgRNA的結(jié)構(gòu)改造進(jìn)一步提升了該系統(tǒng)的基因編輯效率（Molecular Cell，2022）。
1月17日，劉俊杰課題組在《細(xì)胞研究》（Cell Research）雜志在線(xiàn)發(fā)表了題為“緊湊的Casπ(Cas12l)‘手環(huán)’為DNA操作提供了一個(gè)獨(dú)特的結(jié)構(gòu)平臺(tái)”(The compact Casπ(Cas12l)‘bracelet’ provides a unique structural platform for DNA manipulation)的研究論文。報(bào)道了一種自主鑒定的、名為Casπ(Cas12l)的新型CRISPR-Cas12家族核酸酶，Casπ核酸酶通過(guò)識(shí)別CCN PAM來(lái)切割底物DNA，能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效的基因編輯。此外，課題組還解析了Casπ蛋白結(jié)合sgRNA與底物DNA的復(fù)合體結(jié)構(gòu)，揭示該系統(tǒng)底物識(shí)別機(jī)制，為RNA引導(dǎo)的核酸酶系統(tǒng)的進(jìn)化和改造提供了新的視角。
圖 1. CRISPR-Casπ系統(tǒng)的挖掘、鑒定和PAM篩選分析
為了尋找區(qū)別于已知家族的全新CRISPR-Cas系統(tǒng)，課題組首先構(gòu)建了一套優(yōu)化的生物信息挖掘流程，對(duì)Cas蛋白的RuvC結(jié)構(gòu)域序列構(gòu)建隱馬爾可夫模型（HMM），利用多輪迭代，在維持Cas核心特點(diǎn)的同時(shí)，增加差異度。利用該迭代模型結(jié)合多種CRISPR-Cas預(yù)測(cè)方法，課題組在北京和天津的城市污水宏基因組數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)一類(lèi)新型非致病菌來(lái)源的小型CRISPR-Casπ(Cas12l)系統(tǒng)，Casπ蛋白僅由850-867個(gè)氨基酸組成，屬于II類(lèi)-V型CRISPR-Cas系統(tǒng)（圖1）。
課題組通過(guò)PAM篩選實(shí)驗(yàn)證明，Casπ核酸酶識(shí)別CCN PAM，這一性質(zhì)與以往報(bào)道的Cas12家族蛋白均識(shí)別T-richPAM不同，拓展了CRISPR基因編輯工具的靶標(biāo)廣度（圖1）。Casπ的順式切割和反式切割活性與廣泛使用的LbCas12a（1228氨基酸）活性相當(dāng)。系列的生化評(píng)估表明，區(qū)別于一般小型CRISPR-Cas蛋白脆弱的耐受性，Casπ核酸酶對(duì)高低溫度、不同鹽濃度和超高蛋白濃度均具有良好的耐受度，并能被多種二價(jià)離子激活，生化魯棒性強(qiáng)，為Casπ的核酸檢測(cè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
圖 2. Casπ在細(xì)菌體內(nèi)質(zhì)粒切割及哺乳動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)的基因編輯效率結(jié)果展示
為了進(jìn)一步探索Casπ系統(tǒng)的基因編輯潛力。課題組首先嘗試了該系統(tǒng)在原核生物中的DNA切割能力，結(jié)果表明，靶向毒蛋白基因ccdB的Casπ系統(tǒng)，可有效解除ccdB毒性對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制。進(jìn)一步，課題組利用Casπ系統(tǒng)對(duì)HEK293A細(xì)胞系基因組中插入的移碼突變GFP報(bào)道系統(tǒng)位點(diǎn)(out-of-frame EGFP cell line)和內(nèi)源基因位點(diǎn)進(jìn)行編輯操作，并利用深度測(cè)序，分析和評(píng)估了編輯結(jié)果。結(jié)果表明，還未經(jīng)改造優(yōu)化的Casπ可對(duì)真核生物基因組產(chǎn)生有效編輯，與LbCas12a效率相當(dāng)，最高可達(dá)到SpyCas9編輯效率的一半（圖2）。有意思的是，在片段刪除的編輯類(lèi)型中，Casπ主要產(chǎn)生<25nt的短片段刪除。
圖3. Casπ-gRNA-DNA復(fù)合體結(jié)構(gòu)；PRS結(jié)構(gòu)域及“手環(huán)(bracelet)”狀結(jié)構(gòu)模式圖
進(jìn)一步，課題組通過(guò)單顆粒冷凍電鏡技術(shù)解析了Casπ-sgRNA-DNA三元復(fù)合體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與其它已知結(jié)構(gòu)的CRISPR-Cas系統(tǒng)相比，存在四個(gè)新型的、未知功能的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域：LC、PRS、HNC和PCT結(jié)構(gòu)域。其中，PRS結(jié)構(gòu)域作為一條包含69個(gè)氨基酸的長(zhǎng)肽鏈，緊緊包裹著Casπ復(fù)合體，使Casπ-sgRNA-DNA的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)“手環(huán)(bracelet)”狀結(jié)構(gòu)，不同于II類(lèi)中Cas12和Cas9家族蛋白常見(jiàn)的“雙葉型(two-lobe)”結(jié)構(gòu)（圖3）。此外，他們發(fā)現(xiàn)Casπ通過(guò)R390和R392氨基酸殘基特異性識(shí)別CCN PAM，為前期生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了有力支撐。除了新穎的蛋白結(jié)構(gòu)之外，該系統(tǒng)的sgRNA也呈現(xiàn)出獨(dú)特的“雙臂狀(two-armscaffold)”結(jié)構(gòu)。課題組也證明，基于結(jié)構(gòu)的sgRNA序列簡(jiǎn)化，可有效提升Casπ的DNA切割活性。Casπ-sgRNA-DNA三元復(fù)合體結(jié)構(gòu)中包含的新型Cas蛋白結(jié)構(gòu)域和sgRNA的諸多特征為進(jìn)一步優(yōu)化、提升其基因編輯效率提供了許多新的視角。
圖4. RNA指引的核酸酶系統(tǒng)與其RNA共同進(jìn)化的猜想
有趣的是，課題組通過(guò)比較該系統(tǒng)與具有代表性的II類(lèi)CRISPR-CasRNP效應(yīng)復(fù)合物中的Cas蛋白和gRNA分子量，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)“此消彼長(zhǎng)”的相互關(guān)系，即在一個(gè)效應(yīng)復(fù)合物中，如果Cas蛋白越大，gRNA則越小。這樣的分析，幫我們重新審視RNA在CRISPR效應(yīng)蛋白中不可或缺的重要作用，尤其是在小型和微型的CRISPR-Cas系統(tǒng)中。同時(shí)，對(duì)于以縮小Cas蛋白分子量為目標(biāo)的研究，或許要適當(dāng)增加RNA部件，以維持系統(tǒng)活性。結(jié)合“RNA世界”假說(shuō)，課題組提出了CRISPR-Cas效應(yīng)復(fù)合物可能起源于RNA核酶的進(jìn)化假說(shuō)。在這一段歷程中，可能存在一段由RNA主導(dǎo)（而不是蛋白）的進(jìn)化階段，負(fù)責(zé)核酸靶向和切割，蛋白則主要起到輔助作用，用以增強(qiáng)RNA核酶活性（圖4）。課題組也意識(shí)到，這些古早的系統(tǒng)可能已經(jīng)不存在，即使存在，以Cas蛋白為主要參考的挖掘方法可能也無(wú)法鑒定到它們。然而，大量挖掘目前的CRISPR-Cas效應(yīng)復(fù)合物，揭示其中RNA逐漸被蛋白質(zhì)取代的原理，也許能幫助我們通過(guò)計(jì)算機(jī)還原曾經(jīng)的世界。在那個(gè)世界里，RNA是生命活動(dòng)的主要執(zhí)行者。由此看來(lái)，結(jié)構(gòu)性、功能性RNA在未來(lái)的生物技術(shù)發(fā)展中，是值得關(guān)注的潛力分子。
劉俊杰和清華大學(xué)生命學(xué)院副研究員王家為論文共同通訊作者，清華大學(xué)生命學(xué)院2020級(jí)博士研究生孫奧、2020級(jí)博士研究生李承平、生命學(xué)院博士后陳之航、高精尖結(jié)構(gòu)中心卓越學(xué)者張壽悅為本文共同第一作者，清華大學(xué)2018級(jí)博士研究生李丹苑、2019級(jí)博士研究生楊韻、2022級(jí)博士研究生李隆琪，已出站博士后趙玉倩，本科生王愷辰、李炤甫，北京大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院劉思彤研究員和劉金霞參與本文研究。清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)、水木未來(lái)(北京)科技有限公司、國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（北京）和清華大學(xué)基因測(cè)序與分析平臺(tái)為本研究提供了設(shè)備和技術(shù)支持。該研究得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、國(guó)家自然科學(xué)基金和劉俊杰實(shí)驗(yàn)室啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)支持。
論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41422-022-00771-2
供稿：生命學(xué)院
編輯：段穎
審核：周襄楠
