清華新聞網(wǎng)4月18日電 同源重組（Homologous recombination）是一種在進(jìn)化上十分保守的DNA修復(fù)途徑，用于保護(hù)基因組的穩(wěn)定性。在分子克隆領(lǐng)域，同源重組長(zhǎng)期以來(lái)一直被應(yīng)用于在體內(nèi)和體外組裝多個(gè)DNA雙鏈片段。其中許多組裝方案的可行性依賴(lài)于多種類(lèi)型的酶活性，例如目前應(yīng)用十分廣泛的分子克隆方法Gibsonassembly，就利用了DNA外切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶這三種酶活性。在分子克隆中，利用酶產(chǎn)生具有互補(bǔ)序列的單鏈DNA片段對(duì)于DNA雙鏈片段的組裝是必不可少的，而DNA納米結(jié)構(gòu)的自組裝也依賴(lài)于單鏈DNA片段的堿基互補(bǔ)配對(duì)。
運(yùn)用這種思路，研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種酶促組裝具有重疊片段的DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)和雙鏈片段的方法。研究的設(shè)計(jì)引入了一種具有3’至5’外切酶活性的DNA聚合酶（Q5 DNA聚合酶）來(lái)產(chǎn)生單鏈DNA粘末端，以實(shí)現(xiàn)特定的粘末端互補(bǔ)配對(duì)。通過(guò)精心的序列設(shè)計(jì)，Q5 DNA聚合酶的外切酶活性可以在只存在dTTP（不含有dATP、dCTP和dGTP）的情況下，消化預(yù)定序列3’末端只含有A，C和G核苷酸的部分。當(dāng)酶作用到T核苷酸的位點(diǎn)時(shí)，由于體系中dTTP的存在，聚合酶活性會(huì)發(fā)揮作用，與外切酶活性進(jìn)行一場(chǎng)“拔河”拉鋸，從而使得消化作用被終止在特定位點(diǎn)。
圖1.Q5 DNA聚合酶的聚合酶活性（左）和外切酶活性（右）的“拔河”拉鋸
利用這種同一個(gè)酶中不同類(lèi)型酶活性的對(duì)抗，研究實(shí)現(xiàn)了DNA納米結(jié)構(gòu)的自環(huán)化、同源多聚體以及包括二聚體、三聚體和四聚體在內(nèi)的多種異源多聚體，復(fù)雜度最高達(dá)到了25個(gè)單元的一次性組裝。研究還將此方法改進(jìn)并應(yīng)用回分子克隆領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)了“單一酶，一鍋法”的體外DNA雙鏈片段組裝。
圖2.DNA納米結(jié)構(gòu)和雙鏈片段的組裝原理
相關(guān)研究成果由清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院魏迪明分子設(shè)計(jì)課題組（MADlab）和中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部方芳課題組合作完成，論文題目為“具有重疊序列的DNA納米結(jié)構(gòu)和雙鏈片段的酶促組裝”（Enzymatic assembly of DNA nanostructures and fragments with sequence overlaps），于4月17日在線(xiàn)發(fā)表于《美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)志》（Journal of the American Chemical Society）。
清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2020級(jí)博士生陳蓉為本文第一作者，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院魏迪明副教授和中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)部方芳教授為本文的共同通訊作者，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院已畢業(yè)的2018級(jí)本科生任潔靈和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)班2018級(jí)本科生楊雨帆在清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院本科生課程“核酸納米結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)”中主導(dǎo)自主課程項(xiàng)目而為此研究作出了最初的探索。該研究得到科技部、國(guó)家自然科學(xué)基金委、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心、清華大學(xué)春風(fēng)基金、中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)培育項(xiàng)目、中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)校青年創(chuàng)新重點(diǎn)基金項(xiàng)目等的資助。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1021/jacs.3c01214
供稿：生命學(xué)院
題圖設(shè)計(jì)：趙存存
編輯：李華山
審核：郭玲
