清華新聞網(wǎng)5月7日電 5月4日，清華大學(xué)藥學(xué)院錢(qián)鋒教授課題組報(bào)道了一種可用于濕性老年性黃斑變性（wet age-related macular degeneration, wet AMD）的新型高濃度蛋白制劑形式，為具有局部應(yīng)用需求的高濃度蛋白藥物的制劑開(kāi)發(fā)與工業(yè)優(yōu)化提供了一種新的思路。
濕性AMD作為老年人群體的主要致盲原因，其主要病因?yàn)榛颊咭暰W(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（Retinal pigmented epithelium cell, RPE cell）分泌過(guò)量的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF），促使脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層發(fā)生異常增殖，形成發(fā)育不完全的幼稚血管，進(jìn)而出現(xiàn)血漿滲漏，導(dǎo)致患者在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生重度失明。
目前針對(duì)濕性AMD的臨床治療以anti-VEGF蛋白療法為主，以玻璃體內(nèi)注射的方式給藥，注射間隔為每1-3月/次。然而，頻繁地玻璃體內(nèi)注射同樣威脅患者眼部健康。因此，延長(zhǎng)玻璃體內(nèi)藥物注射間隔是濕性AMD蛋白藥物優(yōu)化的主要目標(biāo)?，F(xiàn)有anti-VEGF蛋白藥物均以高濃度溶液形式上市，制劑優(yōu)化較為困難。尋找高濃度、高效、長(zhǎng)效且緩釋的anti-VEGF蛋白制劑形式以滿(mǎn)足濕性AMD治療的臨床需求十分迫切。蛋白質(zhì)晶體混懸液因蛋白濃度高、穩(wěn)定性好、體系黏度低和潛在的緩釋性能成為高濃度蛋白制劑優(yōu)化的非常規(guī)手段。
該研究以納米抗體mNb-WT為模型蛋白藥物，根據(jù)降低蛋白表面構(gòu)象熵、減弱原有優(yōu)勢(shì)晶體不對(duì)稱(chēng)單元內(nèi)部及不對(duì)稱(chēng)單元之間相互作用力，和引入納米抗體類(lèi)似物的策略，對(duì)mNb-WT位于表面的非功能性氨基酸進(jìn)行改造（圖1a），并通過(guò)與VEGF的結(jié)合能力（圖1b）、溶液中的聚集狀態(tài)（圖1c）、蛋白特征性二級(jí)結(jié)構(gòu)比例（圖1d,e）和AlphaFold預(yù)測(cè)的三維結(jié)構(gòu)（圖1f）幾個(gè)層面，證明突變前后的納米抗體具有相似的特征，在藥學(xué)應(yīng)用中彼此具有可替代性。
圖1.mNb-WT與突變體的藥學(xué)相似性驗(yàn)證
根據(jù)上述不同策略設(shè)計(jì)的突變體納米抗體在與mNb-WT相同的結(jié)晶條件下，產(chǎn)生了性質(zhì)完全不同的晶體類(lèi)型。由于上文中驗(yàn)證不同納米抗體之間在藥學(xué)應(yīng)用中彼此具有可替代性，因此，該研究中將mNb-WT及其突變體組成的不同類(lèi)型晶體定義為偽多晶型晶體。晶體信息表明，mNb-WT的原始優(yōu)勢(shì)晶體為P1晶格，招募硫酸根離子輔助納米抗體分子在晶格中排列，馬修斯常數(shù)為1.76?3/Da，對(duì)應(yīng)的晶體溶劑含量約為30%。而對(duì)納米抗體一級(jí)序列進(jìn)行改造可成功誘導(dǎo)其晶體性質(zhì)發(fā)生改變，改變納米抗體在空間中的排列方式，逐步降低晶體溶劑含量至21.92%（表1）。
表1.納米抗體偽多晶型晶體基本信息比較
通過(guò)評(píng)估納米抗體偽多晶型晶體釋放蛋白分子的速率差異，發(fā)現(xiàn)晶體釋放蛋白分子的速率與晶體晶格種類(lèi)和晶體溶劑含量顯著相關(guān)（圖2a,b）。相比具有P1晶格的晶體（mNb-WT、analogue1和analogue2晶體），具有P212121晶格的晶體（mutant2與mutant7晶體）可顯著延緩納米抗體分子的釋放速率，具有更加優(yōu)越的緩釋性能。而當(dāng)晶體的晶格相同時(shí)，更低的晶體溶劑含量，對(duì)于延緩晶體中納米抗體分子的釋放速率具有積極的作用。通過(guò)調(diào)節(jié)mutant7晶體外液中的鋅離子濃度，研究人員進(jìn)一步延緩了mutant7晶體釋放納米抗體的速率，為蛋白晶體混懸液的產(chǎn)業(yè)優(yōu)化提供了一種新的方法（圖2c）。
圖2.納米抗體偽多晶型晶體釋放蛋白分子的速率差異
綜上所述，該研究驗(yàn)證了納米抗體晶體混懸液作為新型長(zhǎng)效緩釋的高濃度蛋白制劑用于濕性AMD治療的可行性，同時(shí)為高濃度蛋白藥物的制劑開(kāi)發(fā)與性質(zhì)優(yōu)化提供了一種新的思路。
相關(guān)研究以“納米抗體多晶型晶體作為長(zhǎng)效玻璃體內(nèi)注射療法用于濕性老年性黃斑變性治療”（Polymorphic nanobody crystals as long-acting intravitreal therapy for wet age-related macular degeneration）為題在《生物工程與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)》（Bioengineering & Translational Medicine）期刊發(fā)表。
清華大學(xué)藥學(xué)院錢(qián)鋒教授和北京協(xié)和醫(yī)院陳有信教授為文章通訊作者，藥學(xué)院2023屆博士畢業(yè)生朱澍芊為文章第一作者，課題組成員唐天昕、黃成楠提供了重要幫助，清華大學(xué)蛋白質(zhì)研究技術(shù)中心X-射線(xiàn)晶體學(xué)平臺(tái)范仕龍老師和陳喜玲老師、水木未來(lái)生物科技公司周珩博士提供了重要技術(shù)支持。研究得到定性擇優(yōu)項(xiàng)目（清華大學(xué)-北京協(xié)和醫(yī)院合作專(zhuān)項(xiàng)）的支持。
論文鏈接：
https://aiche.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/btm2.10523
供稿：藥學(xué)院
題圖設(shè)計(jì)：李柳依
編輯：李華山
審核：郭玲
