清華新聞網(wǎng)8月16日電 冷凍電子斷層成像技術(shù)（cryoET）是一項(xiàng)受到廣泛關(guān)注的可以直接在組織或者細(xì)胞原位研究生物大分子結(jié)構(gòu)的技術(shù)。聚焦離子束（FIB）因能夠提供近乎無(wú)損的樣品減薄方式而成為cryoET最常用的樣品制備方法。然而，如何在FIB減薄樣品的過(guò)程中定位目標(biāo)區(qū)域一直是一個(gè)難題。
8月1日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李雪明課題組在《結(jié)構(gòu)生物學(xué)報(bào)》（Journal of Structural Biology）期刊發(fā)表了題為“在聚焦離子束切割過(guò)程中使用細(xì)胞二次電子成像實(shí)時(shí)定位細(xì)胞結(jié)構(gòu)”（Locating cellular contents duringcryoFIBmilling using cellular secondary-electron imaging）的研究論文。該論文利用細(xì)胞二次電子成像（CESI）技術(shù)，解決了聚焦離子束（FIB）切割樣品中的定位問(wèn)題（圖1）。該技術(shù)基于雙束電鏡中掃描電鏡基本的成像方式，無(wú)需額外的設(shè)備，樣品也無(wú)需經(jīng)過(guò)任何處理即可實(shí)現(xiàn)。該工作討論了CSEI技術(shù)的成像原理，優(yōu)化了CSEI的成像設(shè)置，使其可在主流的雙束電鏡上應(yīng)用，并且經(jīng)過(guò)測(cè)試，該方法在不同的切割條件下都是可信賴(lài)的。
圖1.CESI技術(shù)的工作流程
研究團(tuán)隊(duì)針對(duì)FIB減薄樣品過(guò)程中的定位問(wèn)題，想要開(kāi)發(fā)一種容易操作、普適性的方法。受到層掃技術(shù)的啟發(fā)，研究團(tuán)隊(duì)想到利用掃描電鏡所成的高襯度的圖像進(jìn)行定位。在冷凍狀態(tài)下，掃描電鏡主要利用二次電子進(jìn)行成像，在默認(rèn)狀態(tài)下，二次電子像被用來(lái)觀(guān)察樣品的形貌（圖2a），輔助切割。而對(duì)于FIB切割出來(lái)的平面，二次電子像只能看到模糊的細(xì)菌輪廓（圖2b）。為此，該工作對(duì)于二次電子像的成像原理進(jìn)行探究，并對(duì)影響二次電子像成像的因素進(jìn)行了一一測(cè)試，包括電壓加速、電流、探測(cè)器、成像模式、駐留時(shí)間、工作距離、掃描次數(shù)等。最終，總結(jié)出了在市面上主流FIB中都適用的參數(shù)，使得不同儀器上的二次電子像都能有很好的襯度（圖3）。
圖2.默認(rèn)狀態(tài)下利用掃描電鏡觀(guān)察樣品形貌（左）與FIB減薄后的平面（右）
圖3.大腸桿菌細(xì)胞使用不同F(xiàn)IB設(shè)備成像細(xì)胞二次電子像均能有很好的襯度
為了驗(yàn)證利用CESI技術(shù)進(jìn)行定位的可行性，該工作將CESI技術(shù)應(yīng)用到不同類(lèi)型的樣品上，包括細(xì)菌、單細(xì)胞真核生物衣藻、人皮膚鱗癌細(xì)胞、海拉細(xì)胞、和動(dòng)植物組織（圖4），發(fā)現(xiàn)均能有很好的成像效果。同時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在不同切割的條件下，包括在樣品表面有冰渣的情況下以及大束流的切割條件下，不會(huì)影響CSEI技術(shù)的使用。
圖4.不同類(lèi)型的樣品在CSEI技術(shù)下的成像效果
最后，該研究以衣藻的基體（basal body）為定位對(duì)象，建立了簡(jiǎn)單的切割-定位流程。使用CSEI技術(shù)定位時(shí)，從樣品單側(cè)進(jìn)行減薄，每次FIB減薄后，都使用CSEI技術(shù)進(jìn)行定位。CSEI技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)在切割過(guò)程中進(jìn)行持續(xù)實(shí)時(shí)成像和精確三維定位。
清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李雪明副教授為本文通訊作者。清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2018級(jí)博士生林超（已畢業(yè)）、生命學(xué)院博士后張立、生命學(xué)院2021級(jí)博士生張子穎、蔡司顯微鏡北京客戶(hù)中心工程師蔣藝豐為該論文的共同第一作者。清華大學(xué)博士研究生王思涵（已畢業(yè)），清華大學(xué)周珩博士、趙雅嫻博士，以及潘俊敏教授實(shí)驗(yàn)室博士研究生王正茂，李丕龍副教授實(shí)驗(yàn)室李如博士為本工作提供了細(xì)胞樣品；李曉敏博士和李英博士為樣品制備和數(shù)據(jù)收集提供了大力支持。該研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心、北京生物結(jié)構(gòu)前沿中心和結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心的資助。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.jsb.2023.108005
供稿：生命學(xué)院
題圖設(shè)計(jì)：梁晨
編輯：李華山
審核：郭玲
