清華新聞網(wǎng)8月17日電 真核生物異染色質(zhì)是高度壓縮的染色質(zhì)區(qū)域，富集了DNA/組蛋白甲基化等多種轉(zhuǎn)錄沉默型表觀(guān)修飾和特異的組蛋白變體等因子，對(duì)維持該區(qū)域的基因沉默和基因組穩(wěn)定性起著至關(guān)重要的作用。染色質(zhì)重塑蛋白可通過(guò)調(diào)節(jié)核小體上DNA和組蛋白八聚體之間的相互作用，移動(dòng)、重排和重組染色質(zhì)纖維，從而改變?nèi)旧|(zhì)的緊密程度和三維結(jié)構(gòu)，影響基因的表達(dá)。R-loop是由RNA:DNA雜合鏈和單鏈DNA組成的三鏈核酸結(jié)構(gòu)，在基因組上廣泛存在。清華大學(xué)生命學(xué)院孫前文實(shí)驗(yàn)室前期的全基因組R-loop檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大量低峰度的R-loop富集于擬南芥基因組的異染色質(zhì)區(qū)域1-3，但其相應(yīng)的功能和生物學(xué)意義仍然未知。
8月11日，孫前文實(shí)驗(yàn)室在《科學(xué)·進(jìn)展》（Science Advances）期刊上發(fā)表了題為“DDM1介導(dǎo)的R-loop解除和H2A.Z排斥促進(jìn)擬南芥異染色質(zhì)的形成”（DDM1-mediated R-loop resolution and H2A.Z exclusion facilitates heterochromatinformation in Arabidopsis）的研究論文，揭示了擬南芥中染色質(zhì)重塑蛋白DDM1可通過(guò)解除R-loop結(jié)構(gòu)并排除組蛋白變體H2A.Z來(lái)啟動(dòng)異染色質(zhì)形成的機(jī)制。該研究中，作者收集了眾多影響擬南芥異染色質(zhì)狀態(tài)的突變體并進(jìn)行了全基因組R-loop測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)重塑蛋白DDM1的突變會(huì)引起著絲粒周?chē)鷧^(qū)域異染色質(zhì)R-loop水平顯著升高（圖1）。
圖1.DDM1突變導(dǎo)致著絲粒附近R-loop水平升高
DDM1是SWI/SNF家族蛋白的一員，早在1993年就發(fā)現(xiàn)其突變后會(huì)導(dǎo)致全基因組甲基化水平降低，但背后的機(jī)制仍然未知。通過(guò)ChIP-seq結(jié)果顯示DDM1富集在染色體的著絲粒周?chē)鷧^(qū)域，而DDM1的突變會(huì)引起該區(qū)域的異染色質(zhì)水平下降以及轉(zhuǎn)錄水平升高。有趣的是，轉(zhuǎn)錄抑制劑FLA可以顯著降低ddm1突變體中R-loop在著絲粒附近的富集，同時(shí)部分回補(bǔ)DNA甲基化在ddm1中的缺失（圖2）。這些結(jié)果說(shuō)明，DDM1可抑制與轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)的R-loop異常積累，從而確保著絲粒附近的DNA甲基化等異染色質(zhì)狀態(tài)正常建立。
圖2.轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)R-loop破壞著絲粒附近異染色質(zhì)
DDM1的N端和C端都有保守的解旋酶結(jié)構(gòu)域（圖3A），并且擬南芥ddm1-1突變體在C端解旋酶保守結(jié)構(gòu)域中發(fā)生了C615Y的氨基酸殘基突變。體外結(jié)果顯示，RNA:DNA雜合鏈可以顯著激活DDM1蛋白的ATPase活性，并且體外重組的DDM1蛋白可以RNA從RNA:DNA雜合鏈結(jié)構(gòu)中解離，但是突變體蛋白DDM1C615Y的解旋酶活性顯著下降（圖3）。結(jié)合in vivo數(shù)據(jù)，表明DDM1可以直接清除在異染色質(zhì)區(qū)域瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的R-loop結(jié)構(gòu)，并促進(jìn)異染色質(zhì)形成。
圖3.DDM1解除RNA:DNA雜合鏈
為了深入探索DDM1促進(jìn)異染色質(zhì)形成的機(jī)制，作者通過(guò)結(jié)合免疫沉淀-質(zhì)譜分析尋找DDM1的互作蛋白。結(jié)果顯示，DDM1可以和多種H2A組蛋白變體互作，其中H2A.W與H2A.Z兩種變體在基因組上的分布是互斥的（圖4A和B）。ChIP-seq結(jié)果顯示，DDM1功能缺失的突變體中，著絲粒區(qū)域的H2A.W含量下降，而H2A.Z含量上升（圖4C），說(shuō)明野生型中異染色質(zhì)區(qū)域定位的DDM1阻止了H2A.Z在該區(qū)域富集。體外互作結(jié)果表明，DDM1可以分別與H2A.W-H2B、H2A.Z-H2B二聚體互作（圖4D），但是H2A.W-H2B可以抑制DDM1與H2A.Z-H2B復(fù)合物的形成（圖4E），這也解釋了在野生型中DDM1可以幫助H2A.W定位在著絲粒周?chē)鷧^(qū)域、同時(shí)抑制H2A.Z在該區(qū)域的富集這一現(xiàn)象。有趣的是，DDM1與H2A.W-H2B、H2A.Z-H2B均可抑制DDM1的解旋酶活性（圖4F），而H2A.W的三突變體h2a.w-3中R-loop水平并沒(méi)有顯著升高（圖4C），表明DDM1解除R-loop和調(diào)控H2A變體定位的這兩種功能相互獨(dú)立。
圖4.DDM1抑制H2A.Z在著絲粒附近富集
由于H2A.Z在染色體上的定位由SWR1復(fù)合物介導(dǎo)，作者在ddm1背景下對(duì)擬南芥SWR1復(fù)合物的關(guān)鍵因子ARP6進(jìn)行敲除，發(fā)現(xiàn)ddm1arp6雙突可以一定程度上降低H2A.Z的積累，同時(shí)回補(bǔ)ddm1升高的R-loop和降低的DNA甲基化水平（圖5）。這些結(jié)果說(shuō)明，DDM1可以抑制H2A.Z在著絲粒周?chē)鷧^(qū)域的積累，同時(shí)解除由H2A.Z富集帶來(lái)的轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)R-loop，從而促進(jìn)異染色質(zhì)的形成。
圖5.抑制H2A.Z的富集可回補(bǔ)ddm1中R-loop的異常積累和DNA甲基化缺失
最后，作者發(fā)現(xiàn)DDM1抑制H2A.Z、解除R-loop的功能與花粉核的形態(tài)密切相關(guān)。野生型的花粉中，DDM1在精核（SN, spermnuclei）中富集，而H2A.W也在精核中積累，但H2A.Z和R-loop在營(yíng)養(yǎng)核（VN, vegetative cell nuclei）中富集（圖6A-C）。DDM1功能缺失后，H2A.Z和R-loop信號(hào)可以擴(kuò)散到精核中（圖6B和C），但H2A.W在精核中的聚集狀態(tài)沒(méi)有發(fā)生改變（圖6A）。同時(shí)，ddm1突變體中異常富集的H2A.Z與R-loop伴隨著花粉精核變大、空洞的形成（圖6D）。
圖6.DDM1在精核中解除R-loop和抑制H2A.Z富集
綜上所述，本項(xiàng)研究揭示了擬南芥的一種染色質(zhì)重塑蛋白DDM1的主要功能是排斥異染色質(zhì)區(qū)域的H2A.Z積累并解除R-loop，從而啟動(dòng)異染色質(zhì)的形成，闡明DDM1維持基因組DNA甲基化的分子新機(jī)制和生物學(xué)新功能（圖7）。
圖7.DDM1促進(jìn)異染色質(zhì)形成的工作模式圖
本研究是清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院孫前文副教授實(shí)驗(yàn)室探索R-loop生物學(xué)功能的系列研究之一。孫前文副教授為本文通訊作者，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士后周勁聰為該論文第一作者。該工作也得到了孫前文實(shí)驗(yàn)室2021級(jí)博士研究生雷雪、薩夫拉茲·沙菲克（Sarfraz Shafiq）博士、張衛(wèi)峰博士、李沁博士、李寬博士，廣州大學(xué)董志誠(chéng)教授以及朱家富博士，北京生命科學(xué)研究所何新建高級(jí)研究員的幫助。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家科技部基金、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心的資助。
論文鏈接：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adg2699
供稿：生命學(xué)院
題圖設(shè)計(jì)：李娜
編輯：李華山
審核：郭玲
