清華新聞網(wǎng)1月9日電 轉(zhuǎn)錄和復(fù)制是生物體維持和傳遞遺傳信息的重要事件，它們以同一套基因組為模板，因而常會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)錄-復(fù)制對(duì)撞，誘發(fā)R-loop積累和DNA斷裂，導(dǎo)致基因組損傷。R-loop是由雜合雙鏈RNA:DNA和單鏈DNA組成的三鏈核酸結(jié)構(gòu)，其過(guò)量積累會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，因此生物體進(jìn)化出了一系列機(jī)制調(diào)控基因組內(nèi)R-loop的水平。其中核糖核酸酶RNase H能夠特異消化RNA:DNA雜合鏈中的RNA，從而清除R-loop，維持基因組穩(wěn)定。
1月2日，清華大學(xué)生命學(xué)院孫前文副教授實(shí)驗(yàn)室在《自然·通訊》（Nature Communications）期刊上發(fā)表了題為“引物酶促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制在同一模板鏈上的競(jìng)爭(zhēng)從而導(dǎo)致DNA損傷”（Primase promotes the competition between transcription and replication on the same template strand resulting in DNA damage）的研究論文。該研究揭示了擬南芥葉綠體DNA復(fù)制引物酶促進(jìn)葉綠體基因組的轉(zhuǎn)錄復(fù)制競(jìng)爭(zhēng)和R-loop積累，從而誘發(fā)葉綠體基因組斷裂的分子機(jī)制。
葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，研究人員前期鑒定了擬南芥基因組編碼的三個(gè)RNase H1蛋白，并發(fā)現(xiàn)定位于葉綠體的atrnh1c蛋白可以與DNA Gyrase（拓?fù)洚悩?gòu)酶）互作解除葉綠體基因組的轉(zhuǎn)錄復(fù)制對(duì)撞，清除R-loop，減少DNA的損傷。atrnh1c突變體的葉綠體基因組內(nèi)R-loop過(guò)量積累，高轉(zhuǎn)錄復(fù)制對(duì)撞區(qū)域DNA斷裂增多，從而引發(fā)葉片黃化，植物矮小的表型。
為進(jìn)一步探究參與基因組穩(wěn)定性和R-loop調(diào)控的新因子，研究人員對(duì)atrnh1c突變體進(jìn)行EMS誘變篩選，獲得多個(gè)表型抑制突變體。其中acs1（atrnh1c suppressor 1）突變體無(wú)論是葉片顏色，光合效率，以及葉綠體的數(shù)目和形態(tài)，與atrnh1c相比均有顯著恢復(fù)（圖1a和b）。通過(guò)基因定位和功能驗(yàn)證鑒定到acs1基因編碼一個(gè)葉綠體和線(xiàn)粒體雙向定位的引物酶ATH（圖1c-f）。引物酶在DNA復(fù)制過(guò)程中合成小的RNA片段，引導(dǎo)合成新的DNA鏈。
圖1.葉綠體引物酶ATH點(diǎn)突變通過(guò)減弱其與DNA結(jié)合抑制atrnh1c突變體表型
在acs1突變體中，ATH蛋白的一個(gè)跨物種間高度保守的氨基酸發(fā)生替換，導(dǎo)致蛋白與DNA模板的結(jié)合能力變?nèi)?，合成RNA引物以及介導(dǎo)DNA復(fù)制酶合成DNA的能力下降，從而減緩了轉(zhuǎn)錄-復(fù)制對(duì)撞和R-loop積累，使得atrnh1c突變體的表型缺陷發(fā)生一定程度的恢復(fù)（圖2a-c）。通過(guò)鏈特異性的DNA斷裂測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在葉綠體基因組中高轉(zhuǎn)錄復(fù)制對(duì)撞的rDNA區(qū)域，轉(zhuǎn)錄和后隨鏈的復(fù)制在同一條DNA鏈上進(jìn)行，這條鏈的轉(zhuǎn)錄本末端存在特異且較高程度的單鏈DNA斷裂（圖2d和e）。通過(guò)構(gòu)建葉綠體DNA復(fù)制酶Pol1A與atrnh1c的雙突材料1cpol1a，進(jìn)一步驗(yàn)證了減緩復(fù)制可以減輕轉(zhuǎn)錄-復(fù)制對(duì)撞和R-loop積累，從而維持基因組穩(wěn)定，恢復(fù)atrnh1c突變表型。
圖2.ATH點(diǎn)突變減少葉綠體基因組R-loop積累和轉(zhuǎn)錄-復(fù)制沖突
此外，研究人員發(fā)現(xiàn)超表達(dá)引物酶ATH會(huì)促進(jìn)葉綠體基因組中R-loop過(guò)量積累，誘發(fā)DNA斷裂，并引起植株產(chǎn)生新葉黃化的表型（圖3a和b）；而通過(guò)基因編輯敲除ATH則會(huì)導(dǎo)致胚胎致死，胚胎發(fā)育停滯在球形胚期（圖3c-f）。這些結(jié)果表明細(xì)胞器中的引物酶ATH對(duì)于擬南芥的正常生長(zhǎng)發(fā)育不可或缺。
圖3.適當(dāng)?shù)腁TH表達(dá)對(duì)于植物正常生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義
該研究通過(guò)篩選擬南芥葉綠體中高度積累R-loop的atrnh1c突變體的回復(fù)突變，揭示了引物酶在調(diào)控基因組轉(zhuǎn)錄復(fù)制對(duì)撞中的作用，對(duì)于研究其他物種中的R-loop和基因組穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制具有借鑒意義。同時(shí)，研究也證實(shí)了擬南芥細(xì)胞器引物酶ATH的適當(dāng)表達(dá)水平對(duì)于植物的生長(zhǎng)發(fā)育的重要性。
清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士后張衛(wèi)峰為該論文第一作者，孫前文為該論文通訊作者，孫前文實(shí)驗(yàn)室2016級(jí)已畢業(yè)博士生楊卓和已出站博士后王文杰也參與了該項(xiàng)研究。該研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心、中國(guó)博士后科學(xué)基金等的支持。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-023-44443-0#Ack1
供稿：生命學(xué)院
編輯：李華山
審核：郭玲
