清華新聞網(wǎng)1月31日電 樣品制備已成為冷凍電鏡技術(shù)解析生物樣品高分辨率結(jié)構(gòu)的主要限速步驟。在這個(gè)過(guò)程中，氣液界面效應(yīng)、背景噪音和優(yōu)勢(shì)取向等問(wèn)題可能導(dǎo)致冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析失敗，或者重復(fù)性較差。石墨烯，因其低背景噪音、高機(jī)械強(qiáng)度和高導(dǎo)電性等出色特性，被用作冷凍電鏡樣品制備支撐膜以提升樣品質(zhì)量。
1月22日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王宏偉教授課題組和北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院彭海琳教授課題組合作開(kāi)發(fā)了一種基于石墨烯“三明治”結(jié)構(gòu)的冷凍電鏡生物樣品制備方法，并以“石墨烯三明治技術(shù)用以生物冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析”（Graphene sandwich-based biological specimen preparation for cryo-EM analysis）為題發(fā)表于《美國(guó)科學(xué)院院報(bào)》（Proceedings of the National Academy of Sciences，PNAS）期刊。該研究通過(guò)在兩層石墨烯間封裝生物樣品溶液，制備冰層厚度適宜的石墨烯“三明治”樣品（圖1），用以高分辨冷凍電鏡重構(gòu)。
常規(guī)石墨烯膜制備冷凍電鏡樣品的方法能夠增加顆粒吸附，減輕氣液界面帶來(lái)的干擾。然而，石墨烯支持膜僅存在于冰層一側(cè)，不能消除另一側(cè)氣液界面對(duì)樣品的影響；并且在支撐膜親水性不佳時(shí)，容易出現(xiàn)樣品脫水的現(xiàn)象（圖1a）。為解決這一問(wèn)題，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種石墨烯“三明治”技術(shù)，在生物樣品溶液兩側(cè)都鋪設(shè)石墨烯支持膜，對(duì)生物樣品進(jìn)行封裝，進(jìn)而制備冷凍電鏡樣品，從而徹底避免氣液界面等問(wèn)題的影響（圖1b）。
圖1.采用石墨烯作為支持膜的冷凍電鏡樣品制備示意圖
在制備石墨烯“三明治”樣品的過(guò)程中，先將生物樣品溶液滴加到石墨烯電鏡載網(wǎng)上，然后再將另一層石墨烯轉(zhuǎn)移覆蓋至上述載網(wǎng)表面。為解決上層石墨烯易于卷曲破碎而不便轉(zhuǎn)移的問(wèn)題，研究團(tuán)隊(duì)采用硬脂酸分子輔助石墨烯自支撐地懸浮在緩沖液表面，后將其轉(zhuǎn)移至滴加樣品溶液的石墨烯載網(wǎng)上。這種方法能夠高成功率、高重復(fù)率地實(shí)現(xiàn)石墨烯“三明治”結(jié)構(gòu)封裝樣品溶液。
和常規(guī)單側(cè)石墨烯膜支撐的冷凍樣品相比（圖1a），這種石墨烯“三明治”結(jié)構(gòu)有助于補(bǔ)償因電子束照射而損失的二次電子，減小冷凍樣品在透射電鏡下的電荷積累效應(yīng)。并且，由于石墨烯優(yōu)異的機(jī)械強(qiáng)度，該方法還可以有效防止冰層形變，降低電鏡成像過(guò)程中的顆粒漂移，從而進(jìn)一步提高冷凍電鏡照片的質(zhì)量。采用這種方法制備冷凍樣品，研究團(tuán)隊(duì)成功獲得了成像質(zhì)量更高的冷凍電鏡數(shù)據(jù)，解析了去鐵鐵蛋白、20S蛋白酶體和新冠病毒刺突蛋白的高分辨冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（圖2）。
圖2.石墨烯“三明治”結(jié)構(gòu)應(yīng)用于冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析
王宏偉、彭海琳和清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉楠博士為該論文的共同通訊作者，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2019級(jí)博士生徐潔、北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院2020級(jí)博士生高嘯寅、北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院鄭黎明博士為該論文的共同第一作者。清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2020級(jí)博士生賈霞、清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院徐魁博士、北京大學(xué)工學(xué)院教授韋小丁及其研究生馬瑜薇為該工作提供了重要幫助。
該研究得到國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)研究（北京）設(shè)施清華基地冷凍電鏡平臺(tái)和計(jì)算平臺(tái)的大力協(xié)助，并得到國(guó)家自然科學(xué)基金、騰訊基金會(huì)以及清華大學(xué)水木學(xué)者計(jì)劃的支持。
論文鏈接：
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2309384121
供稿：生命學(xué)院
編輯：李華山
審核：郭玲
