清華新聞網(wǎng)3月19日電 大多數(shù)生理與病理組織都具有高度的細(xì)胞異質(zhì)性。對(duì)異質(zhì)細(xì)胞譜圖的系統(tǒng)解讀以及關(guān)鍵細(xì)胞亞型的精準(zhǔn)鑒定對(duì)于理解組織發(fā)育及其功能、細(xì)胞互作微環(huán)境、疾病動(dòng)態(tài)發(fā)展等生理與病理過(guò)程具有重要價(jià)值。當(dāng)前主流的細(xì)胞異質(zhì)性分析以單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，使用基因表達(dá)譜信息定義細(xì)胞類(lèi)群，繪制了大量復(fù)雜生理與病理組織的異質(zhì)性譜圖。但是長(zhǎng)期以來(lái)，這一類(lèi)異質(zhì)性分析停留于基因?qū)用?，未能達(dá)到基因轉(zhuǎn)錄本的解析度，幾乎完全忽略了RNA可變剪接在塑造生理狀態(tài)、執(zhí)行生物學(xué)功能及驅(qū)動(dòng)疾病發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵作用。
高等真核生物中的RNA可變剪接是重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。通過(guò)剪接模式的變化，細(xì)胞中同一個(gè)基因可以生成多個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本，極大擴(kuò)展了轉(zhuǎn)錄組及蛋白組的復(fù)雜性，體現(xiàn)了基因表達(dá)及功能的多樣性與可塑性。傳統(tǒng)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)僅能反映基因總體表達(dá)豐度，無(wú)法表征轉(zhuǎn)錄后RNA剪接這一重要調(diào)控層級(jí)。因此，復(fù)雜組織的細(xì)胞異質(zhì)性分析有必要補(bǔ)足RNA剪接譜這一關(guān)鍵維度的缺失。
針對(duì)這一重要需求，清華大學(xué)生命學(xué)院楊雪瑞副教授課題組開(kāi)發(fā)了生物信息工具SCASL（single-cell clustering based on alternative splicing landscapes），用于單細(xì)胞RNA剪接譜異質(zhì)性的系統(tǒng)、定量分析，基于剪接譜重新定義細(xì)胞亞群。相關(guān)研究成果以“使用SCASL對(duì)單細(xì)胞RNA剪接譜的解析提出了具有生理學(xué)意義的細(xì)胞身份新定義”（Interrogations of single-cell RNA splicing landscapes with SCASL define new cell identities with physiological relevance）為題，于3月9日發(fā)表于《自然·通訊》（Nature Communications）。
SCASL方法使用單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，在不依賴(lài)于轉(zhuǎn)錄組注釋的前提下，對(duì)不同的可變剪接模式進(jìn)行定量。以此為基礎(chǔ)，SCASL通過(guò)kNN插補(bǔ)，重點(diǎn)解決了單細(xì)胞RNA剪接數(shù)據(jù)的低覆蓋度與高稀疏性問(wèn)題，最后使用譜聚類(lèi)方法對(duì)細(xì)胞亞型進(jìn)行了無(wú)監(jiān)督分類(lèi)，繪制單細(xì)胞RNA剪接異質(zhì)性圖譜。測(cè)試結(jié)果顯示，SCASL在對(duì)稀疏數(shù)據(jù)的插補(bǔ)準(zhǔn)確性、細(xì)胞聚類(lèi)穩(wěn)定性、低頻細(xì)胞類(lèi)群鑒定、隨機(jī)噪音容忍度等方面均表現(xiàn)出色，這也體現(xiàn)出單細(xì)胞剪接譜所包含信息的高冗余度。更重要的是，基于相同的單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)，SCASL利用剪接譜信息對(duì)細(xì)胞身份的定義與僅僅基于基因表達(dá)譜的細(xì)胞聚類(lèi)結(jié)果有顯著差異。
圖1.SCASL分析流程概念示意圖
進(jìn)一步，作者使用了七套已發(fā)表的單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)，對(duì)SCASL剪接譜異質(zhì)性分析結(jié)果的生物學(xué)意義進(jìn)行了深入挖掘和討論。
首先，通過(guò)對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞剪接譜異質(zhì)性的分析，SCASL明確定義了正常上皮細(xì)胞的癌前發(fā)展?fàn)顟B(tài)、早期腫瘤細(xì)胞、惡性腫瘤細(xì)胞及微轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞簇。事實(shí)上，由于腫瘤細(xì)胞高度的異質(zhì)性，特別是基因表達(dá)譜的無(wú)序擾動(dòng)，此前對(duì)腫瘤單細(xì)胞基因表達(dá)譜的聚類(lèi)通常不夠穩(wěn)定，難以明確定義細(xì)胞亞型及其邊界。SCASL的分析結(jié)果表明RNA剪接譜對(duì)于定義細(xì)胞亞型，特別是過(guò)渡態(tài)細(xì)胞，具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，表明RNA可變剪接在驅(qū)動(dòng)腫瘤發(fā)生發(fā)展中潛在的重要作用。
在對(duì)正常組織發(fā)育動(dòng)態(tài)過(guò)程的解讀中，SCASL也表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。例如，SCASL重現(xiàn)了小鼠胚胎肝臟中肝母細(xì)胞發(fā)育為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的兩個(gè)譜系，明確定義了分化譜系中的時(shí)序過(guò)渡態(tài)細(xì)胞。更有趣的是，SCASL基于剪接譜的分析揭示了一個(gè)特殊的細(xì)胞簇，它此前被定義為膽管細(xì)胞，但其剪接譜位于肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞兩個(gè)發(fā)育譜系之間，且同時(shí)表現(xiàn)出兩種細(xì)胞的功能特征，表明其可能代表了肝臟發(fā)育過(guò)程中兩個(gè)細(xì)胞分化路徑之間的交流。
圖2.SCASL重現(xiàn)小鼠胚胎肝細(xì)胞發(fā)育譜系（左），發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞兩個(gè)譜系間的中間態(tài)細(xì)胞（右）
最后，在對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境的分析中，SCASL完成了對(duì)腫瘤相關(guān)T細(xì)胞亞型的精細(xì)鑒定，包括腫瘤浸潤(rùn)的耗竭型、激活型CD8T細(xì)胞、不同功能活性的CD4T細(xì)胞等。以上新的細(xì)胞身份定義為理解免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、激活與耗竭、細(xì)胞互作調(diào)控等重要過(guò)程提供了新的線(xiàn)索，特別是重要基因的RNA可變剪接對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境的塑造。
該研究為復(fù)雜組織中細(xì)胞異質(zhì)性的解讀提出了新的視角與方法。通過(guò)這一技術(shù)的應(yīng)用，研究深入分析了多個(gè)重要的生物學(xué)過(guò)程，提出一系列新觀(guān)察、新線(xiàn)索與新發(fā)現(xiàn)。
清華大學(xué)生命學(xué)院2019級(jí)博士生向賢珂為論文第一作者，楊雪瑞為論文通訊作者。北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心教授張澤民及團(tuán)隊(duì)成員何堯博士為研究提供了數(shù)據(jù)、工具等方面的重要貢獻(xiàn)。研究得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金委、國(guó)家高層次人才特殊支持計(jì)劃、清華大學(xué)的資助。國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)研究（北京）設(shè)施（清華大學(xué)蛋白質(zhì)研究技術(shù)中心）下屬生物計(jì)算平臺(tái)、基因測(cè)序與分析平臺(tái)為研究提供了大力支持。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-46480-9
供稿：生命學(xué)院
編輯：李華山
審核：郭玲
