清華新聞網(wǎng)5月9日電 PROTAC（PROteolysis TArgeting Chimera，靶向蛋白降解嵌合體）技術(shù)是近年來(lái)新興的前沿化學(xué)生物技術(shù)。其原理是通過(guò)一個(gè)異雙功能小分子同時(shí)拉近目標(biāo)蛋白和E3泛素連接酶之間的距離，進(jìn)而誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白的多聚泛素化以及通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑的降解。截至目前，該技術(shù)已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了上百種靶蛋白的降解。
天然產(chǎn)物作為藥物發(fā)現(xiàn)的重要來(lái)源，擁有多樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)及廣泛的生物學(xué)活性。通過(guò)表型篩選，科學(xué)家們能夠深入地了解受天然產(chǎn)物影響的細(xì)胞表型、信號(hào)通路和疾病表型，但天然產(chǎn)物精準(zhǔn)的靶點(diǎn)鑒定仍然是該領(lǐng)域面臨的主要挑戰(zhàn)。由于天然產(chǎn)物通常具有多靶點(diǎn)特性，并且與靶蛋白的結(jié)合力中等或偏弱，現(xiàn)有的靶點(diǎn)鑒定策略在鑒定天然產(chǎn)物的特定靶點(diǎn)時(shí)面臨著一定的挑戰(zhàn)。
目前最為主流的靶點(diǎn)鑒定策略是基于活性的蛋白質(zhì)分析（Activity-Based Protein Profiling，ABPP）。該策略的原理是先通過(guò)小分子與靶蛋白之間形成共價(jià)鍵，隨后通過(guò)linker引入報(bào)告基團(tuán)如熒光基團(tuán)或biotin，再通過(guò)凝膠熒光成像或biotin富集后的定量蛋白質(zhì)組學(xué)來(lái)進(jìn)行靶點(diǎn)鑒定。對(duì)于非共價(jià)小分子，ABPP需要外源引入光交聯(lián)基團(tuán)來(lái)實(shí)現(xiàn)共價(jià)交聯(lián)。盡管該技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用于小分子藥物的靶點(diǎn)鑒定，但它仍存在一些局限性。其高度依賴(lài)于小分子與靶蛋白之間的結(jié)合力，因此需要形成穩(wěn)定的共價(jià)相互作用，而光交聯(lián)基團(tuán)的引入條件較為苛刻，且會(huì)產(chǎn)生大量的非特異性結(jié)合并對(duì)組學(xué)結(jié)果的分析造成一定的干擾。目前尚缺少一種基于非共價(jià)結(jié)合的靶點(diǎn)鑒定策略，而PROTAC技術(shù)的出現(xiàn)有望填補(bǔ)該空白。PROTAC的本質(zhì)是小分子誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)互作，其不完全依賴(lài)于小分子與靶蛋白之間的結(jié)合力，理論上，弱結(jié)合靶蛋白通過(guò)PROTAC技術(shù)也能夠?qū)崿F(xiàn)高效的降解。
近期，清華大學(xué)藥學(xué)院饒燏課題組結(jié)合了PROTAC技術(shù)與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)性地提出了全新的靶點(diǎn)鑒定策略——基于降解的蛋白質(zhì)分析（Degradation-Based Protein Profiling，DBPP），并將其應(yīng)用于中藥活性成分雷公藤紅素的靶點(diǎn)鑒定（圖1）。通過(guò)使用一整套PROTAC工具箱，研究人員成功鑒定了雷公藤紅素的三個(gè)已知靶點(diǎn)PI3Kα、IKKβ、CIP2A以及三個(gè)潛在新靶點(diǎn)CHK1、OGA、ERCC6L，證明了該策略的強(qiáng)大能力。DBPP策略是PROTAC技術(shù)在靶點(diǎn)鑒定領(lǐng)域的新應(yīng)用，為解決領(lǐng)域內(nèi)關(guān)鍵問(wèn)題提供了新方法。
圖1.ABPP與DBPP對(duì)比模式圖
首先，研究人員基于雷公藤紅素的構(gòu)效關(guān)系研究構(gòu)建了相應(yīng)的PROAC化合物庫(kù)（圖2）。綜合考慮細(xì)胞表型、linker的長(zhǎng)度及類(lèi)型等多個(gè)因素，他們挑選出由四個(gè)PROTAC分子組成的靶點(diǎn)鑒定工具箱。
圖2.PROTAC化合物庫(kù)的構(gòu)建及工具箱的選擇
隨后，他們分別對(duì)工具箱中的PROTAC分子進(jìn)行了TMT標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)（圖3）。綜合組學(xué)分析結(jié)果與雷公藤紅素的生物學(xué)功能，他們初步挑選了包括PI3Kα、IKKβ、CHK1、OGA、NEK7、DCAF16在內(nèi)的六個(gè)潛在靶點(diǎn)。通過(guò)對(duì)上述靶點(diǎn)的初步驗(yàn)證，他們進(jìn)一步聚焦于PI3Kα、IKKβ、CHK1和OGA的研究。在此過(guò)程中，他們發(fā)現(xiàn)不同的分子對(duì)不同的靶蛋白表現(xiàn)出了一定程度的降解選擇性，該結(jié)果與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的初衷相符合。
接著，他們對(duì)上述靶點(diǎn)開(kāi)展了進(jìn)一步的驗(yàn)證工作。他們先通過(guò)兩個(gè)已知靶點(diǎn)PI3Kα、IKKβ建立了一套適用于DBPP的評(píng)估體系，其中包括靶蛋白降解普適性的驗(yàn)證、降解機(jī)制的驗(yàn)證、三元復(fù)合物形成的驗(yàn)證以及雷公藤紅素與靶蛋白之間直接相互作用的驗(yàn)證，并將該體系成功應(yīng)用于新靶點(diǎn)CHK1和OGA的研究。
最后，他們對(duì)DBPP策略進(jìn)行了兩個(gè)方面的優(yōu)化。通過(guò)綜合分析降解組學(xué)和IP組學(xué)以及引入混合分子蛋白質(zhì)組學(xué)的方式，他們進(jìn)一步提高了該策略的效率及準(zhǔn)確性。
圖3. 靶點(diǎn)驗(yàn)證及策略?xún)?yōu)化
綜上，研究人員將PROTAC技術(shù)與多種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，提出并進(jìn)一步優(yōu)化了DBPP非共價(jià)靶點(diǎn)鑒定新策略，該策略不僅適用于天然產(chǎn)物的靶點(diǎn)鑒定，還可用于現(xiàn)有藥物分子的脫靶研究以及老藥新用。通過(guò)與現(xiàn)有的靶點(diǎn)鑒定策略相互補(bǔ)充，DBPP策略有望推動(dòng)藥學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。
4月25日，相關(guān)研究成果以“基于降解的蛋白質(zhì)分析策略：以雷公藤紅素的靶點(diǎn)研究為例”（Degradation-Based Protein Profiling: A Case Study of Celastrol）為題，發(fā)表于《先進(jìn)科學(xué)》（Advanced Science）。
清華大學(xué)藥學(xué)院饒燏課題組2018級(jí)博士生倪智豪、2020級(jí)博士生施奕（CLS項(xiàng)目）為論文共同第一作者，清華大學(xué)藥學(xué)院教授饒燏為論文通訊作者，清華大學(xué)藥學(xué)院2020級(jí)博士生劉乾隆、已畢業(yè)博士王立國(guó)以及昌平實(shí)驗(yàn)室研究員孫秀云參與了該工作。研究得到首都醫(yī)科大學(xué)教授高偉和清華大學(xué)教授鄧海騰的幫助，并得到清華大學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)與組學(xué)平臺(tái)的技術(shù)支持。研究還得到中國(guó)國(guó)家自然科學(xué)基金和國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃的大力支持。
論文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202308186
供稿：藥學(xué)院
編輯：李華山
審核：郭玲
