清華新聞網(wǎng)10月24日電 2022年爆發(fā)的猴痘疫情已蔓延至全球123個(gè)國(guó)家和地區(qū)，截至2024年9月，實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)的感染病例累計(jì)已超10.9萬(wàn)例，導(dǎo)致236人死亡。世界衛(wèi)生組織在2022年和2024年兩度就猴痘疫情發(fā)布最高級(jí)別預(yù)警，宣布其構(gòu)成“國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”（public health emergency of international concern, PHEIC）。
猴痘病毒是一種直徑可達(dá)350nm的巨型囊膜病毒。它擁有近200kbp的雙鏈DNA基因組，編碼了180余種蛋白質(zhì)，相較于其他病毒而言組分構(gòu)成極其復(fù)雜且體型龐大。加之其高致病性及傳染性特征，至今尚無(wú)完整、真實(shí)猴痘病毒粒子的冷凍電鏡照片或結(jié)構(gòu)公開(kāi)。
10月22日，清華大學(xué)生命學(xué)院李賽課題組與中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所應(yīng)急技術(shù)中心譚文杰團(tuán)隊(duì)合作，以“猴痘成熟病毒粒子的分子構(gòu)造”（Molecular Architecture of Monkeypox Mature Virus）為題在《細(xì)胞·發(fā)現(xiàn)》（Cell Discovery）發(fā)文，揭示了滅活猴痘病毒成熟病毒粒子及其內(nèi)核上柵欄蛋白與孔道復(fù)合物的原位結(jié)構(gòu)與組裝模式，并首次報(bào)道了2022-2023年流行的兩個(gè)代表性猴痘病毒毒株中存在異常組裝模式的現(xiàn)象。
研究團(tuán)隊(duì)在中國(guó)疾病預(yù)防控制中心BSL-3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分離培養(yǎng)猴痘病毒并充分滅活。滅活樣品經(jīng)多輪驗(yàn)證并確認(rèn)完全失去感染性后，被密封運(yùn)送至清華大學(xué)BSL-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了在保留真實(shí)病毒形貌的同時(shí)克服成像襯度、樣品豐度等方面的挑戰(zhàn)，研究團(tuán)隊(duì)優(yōu)化調(diào)整了病毒粒子的提純方案，得到高純度、高豐度、高分散性、無(wú)感染性但又保留了完整病毒形態(tài)的猴痘病毒粒子樣品。團(tuán)隊(duì)首先對(duì)中國(guó)大陸首個(gè)輸入性病例的猴痘病毒毒株（clade IIb B.1）進(jìn)行了冷凍電子斷層成像（cryo-ET），發(fā)現(xiàn)大部分病毒粒子呈“圓餅”狀，其長(zhǎng)軸和短軸長(zhǎng)度約為310nm和270nm。病毒的基因組被包裹在一個(gè)完整的、形似紅細(xì)胞的兩面凹內(nèi)核中，內(nèi)核壁由外層的柵欄狀蛋白和下方的內(nèi)壁蛋白組成；在內(nèi)核的兩側(cè)各有一個(gè)含大量蛋白的側(cè)體，側(cè)體和內(nèi)核一起被包裹在一層囊膜內(nèi)，囊膜表面覆有密集的病毒刺突蛋白（圖1）。
圖1.猴痘病毒成熟病毒粒子的冷凍電子斷層圖像（正面及側(cè)面）
通過(guò)子斷層平均（sub-tomogram averaging）方法，團(tuán)隊(duì)解析了這些常規(guī)形態(tài)病毒粒子內(nèi)核上柵欄蛋白的原位結(jié)構(gòu)（圖2，i）。該結(jié)構(gòu)在整體上與Alphafold2預(yù)測(cè)的A10三聚體擬合良好，但局部體現(xiàn)出一定的差異性。首先，其頂部橫截面處可見(jiàn)每個(gè)A10單體亞基側(cè)面均存在一未知的多余密度與相鄰亞基相連。其次，其中心橫截面處未呈現(xiàn)出預(yù)測(cè)的連接密度。前人研究已發(fā)現(xiàn)該連接密度在痘苗病毒（VACV）的柵欄蛋白中真實(shí)存在。結(jié)合猴痘病毒與痘苗病毒的序列比較，推測(cè)該結(jié)構(gòu)差異可能與猴痘病毒在兩亞基相互作用界面上攜帶的氨基酸突變導(dǎo)致的電荷變化有關(guān)。
通過(guò)分析柵欄蛋白的組裝規(guī)律，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)它們可靈活地排布成單元間距約為9nm的蜂巢狀結(jié)構(gòu)（圖2，ii）。在內(nèi)核上，團(tuán)隊(duì)也發(fā)現(xiàn)了花朵狀的孔道復(fù)合體（圖2，iii）。這些孔道復(fù)合體由六個(gè)柵欄蛋白圍繞一個(gè)孔道復(fù)合體構(gòu)成，并局部擾亂周邊柵欄蛋白的蜂巢狀排列模式。這些看似隨機(jī)分布的花朵狀孔道復(fù)合體可能與病毒早期轉(zhuǎn)錄階段的物質(zhì)進(jìn)出有關(guān)。
圖2.猴痘病毒內(nèi)核表面柵欄蛋白與孔道復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和組裝模式
基于解析得到的蛋白結(jié)構(gòu)和分布，團(tuán)隊(duì)將一顆代表性猴痘成熟病毒粒子進(jìn)行重構(gòu)，得到病毒分子構(gòu)造模型（圖3）。該模型在分子層面展示了真實(shí)猴痘成熟病毒粒子的結(jié)構(gòu)和組裝規(guī)律。
圖3.代表性猴痘病毒成熟病毒粒子的分子構(gòu)造模型
然而，以上所示的常規(guī)形態(tài)猴痘病毒僅占據(jù)全部病毒粒子約60%的比例，其余近40%病毒粒子則與以往報(bào)道的正痘病毒形態(tài)不同，其內(nèi)核壁折疊成扁平囊狀、卷曲層狀或形成多個(gè)獨(dú)立的小核，病毒內(nèi)部的內(nèi)核構(gòu)造并不似紅細(xì)胞一樣閉合且雙面凹陷。
圖4.異常形態(tài)猴痘病毒粒子的電子斷層圖像與內(nèi)核壁折疊模式
為了判斷異常形態(tài)病毒是否廣泛存在，研究團(tuán)隊(duì)又對(duì)C.1毒株進(jìn)行了同樣的觀(guān)測(cè)。這一毒株分離自中國(guó)大陸首例本土傳播病例，其出現(xiàn)晚于B.1毒株，自2023年中逐漸成為主要流行毒株之一。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，盡管C.1毒株也存在類(lèi)似的異常形態(tài)顆粒，其出現(xiàn)率卻顯著低于B.1毒株（圖5）。這表明該毒株的內(nèi)核組裝成功率顯著提升，一定程度上反映出伴隨著2022-2023年的流行傳播，clade IIb猴痘病毒可能發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化并逐漸形成了更加高效的內(nèi)核組裝機(jī)制。
圖5.C.1毒株中異常形態(tài)猴痘病毒粒子出現(xiàn)率顯著低于B.1毒株
研究通過(guò)揭示真實(shí)猴痘病毒的分子構(gòu)造，發(fā)現(xiàn)2022年至今主要流行的兩個(gè)代表性毒株存在不同比例的異常形態(tài)病毒粒子，提示猴痘病毒在內(nèi)核組裝方面可能發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化。然而其他猴痘病毒分支與毒株，特別是2024年8月爆發(fā)的cladeIb分支毒株是否存在類(lèi)似特征，這些異形病毒顆粒的形成機(jī)制，及這些毒株的形態(tài)是否和致病性存在關(guān)聯(lián)等問(wèn)題還有待進(jìn)一步探索。此外，本研究主要揭示了猴痘病毒內(nèi)核表面的分子構(gòu)造，但更多結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，如內(nèi)核中基因組如何組裝、囊膜表面刺突蛋白的結(jié)構(gòu)和分布規(guī)律，猴痘主要抗原與受體、中和抗體的結(jié)合機(jī)制等是下一步的研究重點(diǎn)。
清華大學(xué)生命學(xué)院、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、清華-北大生命聯(lián)合中心、膜生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李賽副教授和中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所應(yīng)急技術(shù)中心譚文杰主任為論文共同通訊作者。清華大學(xué)生命學(xué)院2021級(jí)博士生洪燁、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所應(yīng)急技術(shù)中心黃保英研究員和清華大學(xué)生命學(xué)院、清華-北大生命聯(lián)合中心博士后張俊霞博士為論文共同第一作者。李賽課題組2020級(jí)博士生彭程和2021級(jí)博士生孔維正參與了部分工作。
研究得到國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)研究（北京）設(shè)施清華基地冷凍電鏡平臺(tái)，生物計(jì)算平臺(tái)，細(xì)胞影像平臺(tái)和公共生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的技術(shù)支持。同時(shí)得到國(guó)家自然科學(xué)基金、清華大學(xué)春風(fēng)基金、清華大學(xué)篤實(shí)基金、清華-北大生命聯(lián)合中心、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、膜生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等支持。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41421-024-00741-5
供稿：生命學(xué)院
編輯：李華山
審核：郭玲
