清華新聞網(wǎng)12月9日電 咳嗽是一種重要的呼吸道防御性反射，能夠清理呼吸道的異物及入侵病原，同時(shí)，咳嗽也是眾多呼吸道疾病如哮喘、新冠病毒感染后遺癥等的共同癥狀之一。雖然咳嗽是保護(hù)呼吸道的重要反射，但是在病理狀態(tài)下，咳嗽反射被過(guò)度激活，引發(fā)慢性咳嗽，當(dāng)前的治療策略難以根除，極大地影響了患者的生活質(zhì)量。目前，大部分研究咳嗽的工作主要使用豚鼠、貓等動(dòng)物，繁殖成本高且缺乏有效的遺傳工具，使用小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物能為咳嗽研究提供更多的可操控遺傳工具。然而，目前階段仍未有能在小鼠上清晰地分辨出咳嗽行為的范式。此外，咳嗽的中樞環(huán)路機(jī)制至今空白，解析控制咳嗽的中樞環(huán)路或能為理解慢性咳嗽的病理機(jī)制提供新思路。
近日，清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院曹鵬實(shí)驗(yàn)室在《創(chuàng)新》（The innovation）雜志在線(xiàn)發(fā)表了題為“腦干阿片類(lèi)肽能神經(jīng)元調(diào)節(jié)小鼠的咳嗽反射”（Brainstem opioid peptidergic neurons regulate cough reflexes in mice）的研究論文。該研究開(kāi)發(fā)了一種嶄新的三通道咳嗽行為范式，能同時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠胸膜內(nèi)壓（Intrapleural pressure，IPP）、腔內(nèi)氣流（Boxflow）及超聲（Ultra sound），并區(qū)分出咳嗽和打噴嚏兩種截然不同的呼吸道防御性反射，同時(shí)使用該行為范式，發(fā)現(xiàn)了小鼠孤束核（NTS）中的一群向呼吸中樞cVRG的谷氨酸能神經(jīng)元投射的特異性的強(qiáng)啡肽能（Pdyn）神經(jīng)元對(duì)咳嗽反射至關(guān)重要。
研究人員首先開(kāi)發(fā)了一套可定量分析小鼠咳嗽的行為范式：通過(guò)使用全身體積掃描儀（whole-body plethysmography，WBP）、體內(nèi)植入遙測(cè)裝置、超聲麥克風(fēng)，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠所在腔體的氣流波動(dòng)（Boxflow）、胸膜內(nèi)壓（IPP）及細(xì)微聲音變化（Sonogram）。在該系統(tǒng)中使用辣椒素成功誘導(dǎo)出Class I 和Class II兩種聲音頻率、時(shí)長(zhǎng)截然不同的氣道防御性反射。由于NG和TG的神經(jīng)末梢分別大量支配著喉部和鼻腔黏膜，研究人員隨后使用化學(xué)遺傳抑制病毒（hM4Di）分別/同時(shí)抑制支配呼吸道的NG和TG中的Trpv1+神經(jīng)元，分別/同時(shí)抑制了Class I 和Class II反射，并分辨Class I為咳嗽反射。
利用辣椒素刺激FosTRAP2小鼠，研究人員定位到dorsal vagal complex（DVC）腦區(qū)響應(yīng)辣椒素引發(fā)的生理性咳嗽，通過(guò)對(duì)NTS的FISH染色，發(fā)現(xiàn)三種啡肽類(lèi)物質(zhì)（強(qiáng)啡肽prodynorphin，腦啡肽proenkephalin，內(nèi)啡肽proopiomelanocortin）特異性表達(dá)在DVC，通過(guò)化學(xué)遺傳抑制DVC中的Pdyn，Penk及Pomc神經(jīng)元。其中，Pdyn+神經(jīng)元抑制能顯著減少辣椒素或檸檬酸引發(fā)的咳嗽。
同時(shí)，研究人員對(duì)Pdyn-Cre小鼠的NTS腦區(qū)注射AAV-DIO-GCaMP并包埋光纖，利用光纖記錄手段，研究人員發(fā)現(xiàn)小鼠的呼吸與GCaMP信號(hào)存在偶聯(lián)且咳嗽能大幅度引起Pdyn+NTS神經(jīng)元GCaMP信號(hào)上升，但是打噴嚏則對(duì)Pdyn+NTS神經(jīng)元GCaMP信號(hào)無(wú)明顯影響，為了進(jìn)一步確定Pdyn+NTS神經(jīng)元與咳嗽相關(guān)的GCaMP信號(hào)是否由外周的Trpv1+迷走神經(jīng)傳入，研究人員使用單側(cè)迷走神經(jīng)截?cái)嘈g(shù)或Trpv1-KO小鼠進(jìn)行Pdyn+NTS神經(jīng)元的光纖記錄實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)單側(cè)迷走神經(jīng)截?cái)嘈g(shù)或Trpv1的敲除，均能減弱咳嗽引發(fā)的Pdyn+NTS神經(jīng)元GCaMP信號(hào)的上升，從而確認(rèn)了Pdyn+NTS神經(jīng)元接收來(lái)自Trpv1+迷走神經(jīng)的信號(hào)輸入并響應(yīng)咳嗽。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證Pdyn+NTS神經(jīng)元的激活是否是引發(fā)咳嗽的充分條件，研究人員對(duì)Pdyn-Cre小鼠NTS腦區(qū)雙側(cè)注射了AAV-DIO-hM3Dq，使用化學(xué)遺傳學(xué)手段激活Pdyn+NTS神經(jīng)元，結(jié)果表明，這群神經(jīng)元的激活能有效引起咳嗽且不改變小鼠的呼吸速率，由此激發(fā)的咳嗽各類(lèi)指標(biāo)與辣椒素誘發(fā)的咳嗽一致。此外，研究人員對(duì)Pdyn-Cre小鼠的NTS腦區(qū)注射AAV-DIO-ChR2并包埋光纖，光激活Pdyn+NTS神經(jīng)元同樣能有效地誘發(fā)咳嗽。這些結(jié)果表明，Pdyn+NTS神經(jīng)元的激活對(duì)誘發(fā)咳嗽反射是充分條件。
為了探究Pdyn+NTS神經(jīng)元的下游通路，研究人員對(duì)Pdyn-Cre小鼠NTS腦區(qū)注射AAV-DIO-EGFP-Syb2，發(fā)現(xiàn)EGFP+的末梢主要出現(xiàn)在cVRG及同側(cè)中間網(wǎng)狀核（IRt）。為確定Pdyn+NTS-cVRG和Pdyn+NTS-IRt在咳嗽反射中的作用，研究人員在Pdyn-Cre小鼠NTS腦區(qū)注射AAV-DIO-hM4Di并在cVRG或IRt包埋給藥管，通過(guò)精準(zhǔn)腦區(qū)遞送CNO抑制來(lái)自Pdyn+NTS的信號(hào)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pdyn+NTS-cVRG的抑制能有效減少辣椒素誘發(fā)的咳嗽，表明Pdyn+NTS-cVRG環(huán)路功能對(duì)咳嗽反射是必要的。為進(jìn)一步確定Pdyn+NTS-cVRG環(huán)路在咳嗽反射的功能，研究人員對(duì)Pdyn-Cre小鼠的NTS注射AAV-DIO-ChR2并在cVRG包埋光纖，結(jié)果表明光激活NTS-cVRG的末梢能穩(wěn)定地引發(fā)咳嗽反射。此外，研究人員對(duì)WT小鼠的cVRG注射AAV-ChR2-EYFP并包埋光纖，直接對(duì)cVRG的激活也能穩(wěn)定地引發(fā)咳嗽反射。接下來(lái)，研究人員研究了Pdyn+NTS cVRG通路是否與咳嗽相關(guān)肌肉通過(guò)突觸連接。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，研究人員將AAV-DIO-EGFP-Syb2注射到Pdyn IRES Cre小鼠的DVC中，并將表達(dá)dsRed的偽狂犬病毒（PRV）注射到橫膈膜、肋間肌和腹部肌三個(gè)肌肉群中，實(shí)現(xiàn)dsRed+神經(jīng)元在幾個(gè)大腦區(qū)域逆行標(biāo)記。在cVRG中，dsRed+神經(jīng)元與源自Pdyn+NTS神經(jīng)元的EGFP-syb2+軸突末梢相互分散。這些形態(tài)學(xué)結(jié)果表明，Pdyn+NTS cVRG通路可能通過(guò)跨突觸調(diào)節(jié)咳嗽相關(guān)肌肉，進(jìn)而調(diào)控咳嗽反射。
綜上所述，研究開(kāi)發(fā)了一種三通道監(jiān)測(cè)的小鼠咳嗽行為范式，并以此范式揭示了一條調(diào)控咳嗽反射的特異性環(huán)路：Pdyn+NTS-cVRG，為后續(xù)咳嗽的深層神經(jīng)機(jī)制研究奠定重要基礎(chǔ)。
三通道監(jiān)測(cè)的小鼠咳嗽行為范式
清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院高級(jí)研究員曹鵬為論文通訊作者。曹鵬實(shí)驗(yàn)室2022級(jí)TIMBR博士生盧海成、2022級(jí)PTN博士生鄭文萱，博士后陳國(guó)慶、趙淼、谷華婷、黃美珠，首都醫(yī)科大學(xué)碩士生李夏婷為論文共同第一作者。研究得到北京市科委、清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院以及北京生命科學(xué)研究所的資助。
論文鏈接：
https://www.cell.com/the-innovation/fulltext/S2666-6758(24)00159-0
供稿：生物醫(yī)學(xué)交叉研究院
編輯：李華山
審核：郭玲
