清華新聞網(wǎng)1月3日電 CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種廣泛應(yīng)用的基因編輯工具，該系統(tǒng)通過(guò)引導(dǎo)RNA（gRNA）引導(dǎo)Cas蛋白識(shí)別并切割靶標(biāo)DNA。近年來(lái)，隨著生物信息學(xué)和生物化學(xué)研究的深入，CRISPR系統(tǒng)的多樣性得到了極大擴(kuò)展，尤其是在第V型家族中，這類(lèi)系統(tǒng)依賴(lài)于高度保守的RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域來(lái)實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)切割。作為第V型家族的一個(gè)獨(dú)特亞型，CRISPR-Cas12e（也稱(chēng)為CasX）以其較小的分子尺寸和高效的基因編輯潛力而備受關(guān)注。已鑒定的DpbCas12e和PlmCas12e同源蛋白在蛋白序列和結(jié)構(gòu)方面高度保守。不久之前，清華大學(xué)生命學(xué)院陳春來(lái)與劉俊杰（Gogo）課題組合作揭示了二者在靶標(biāo)搜索和切割過(guò)程的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制。然而，CRISPR-Cas12e系統(tǒng)的進(jìn)化豐富性，以及功能和結(jié)構(gòu)的差異性長(zhǎng)期以來(lái)缺乏系統(tǒng)性的研究。
2024年12月30日，劉俊杰課題組再次聯(lián)合陳春來(lái)課題組以及北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院的蘇丁丁課題組在《自然·通訊》（Nature Communications）發(fā)表了題為“Cas12e同源蛋白進(jìn)化出多樣的結(jié)構(gòu)特征來(lái)促進(jìn)雙鏈DNA的解旋”（Cas12e orthologs evolve variable structural features to facilitate dsDNA cleavage）的研究論文。這項(xiàng)研究系統(tǒng)地鑒定了六種新型Cas12e同源蛋白，通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生化實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)解析了這些蛋白在識(shí)別DNA靶標(biāo)、雙鏈DNA解旋和切割中的獨(dú)特機(jī)制。
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)生物信息學(xué)分析出六種新的Cas12e同源蛋白，其大小在818-920個(gè)氨基酸殘基（圖1）。從預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)上分析，這些蛋白的非靶標(biāo)鏈結(jié)合（NTSB）結(jié)構(gòu)域有明顯差別。生化實(shí)驗(yàn)表明，Cas12e蛋白偏好識(shí)別富含T或C的PAM序列，并且表現(xiàn)出多樣的靶向DNA干擾能力。利用單分子FRET實(shí)驗(yàn)，研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Cas12e蛋白的切割效率與鹽濃度密切相關(guān)。在低鹽條件下，這些蛋白表現(xiàn)出更高的R-loop形成能力和切割活性，而高鹽條件則會(huì)顯著抑制其活性（圖1）。這一結(jié)果揭示了鹽濃度對(duì)Cas12e功能的調(diào)控作用，并為其在復(fù)雜環(huán)境中的應(yīng)用優(yōu)化提供了指導(dǎo)。
圖1.新型CRISPR-Cas12e系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和生化活性
進(jìn)一步，課題組通過(guò)單顆粒冷凍電鏡技術(shù)解析了VemCas12e和LesCas12e的三元復(fù)合體結(jié)構(gòu)。分析發(fā)現(xiàn)，在高鹽條件下，同源蛋白間不同的R-loop形成能力和Cas蛋白中負(fù)責(zé)解旋DNA雙鏈的結(jié)構(gòu)有關(guān)（圖2）。部分Cas12e蛋白（如PlmCas12e和DpbCas12e）含有獨(dú)特NTSB結(jié)構(gòu)域。這一結(jié)構(gòu)域能夠在高鹽條件下促進(jìn)DNA解旋而增強(qiáng)切割活性。相比之下，缺乏該結(jié)構(gòu)域的Cas12e蛋白（如VemCas12e和LesCas12e）則依賴(lài)富含正電氨基酸殘基的短肽環(huán)結(jié)構(gòu)（如Loop 1和Loop 2）進(jìn)行DNA解旋，但其對(duì)R-loop形成的促進(jìn)作用相對(duì)較小，因而切割效率相對(duì)較低。總之，能夠在高鹽濃度條件下促進(jìn)R-loop穩(wěn)定形成的結(jié)構(gòu)有利于實(shí)現(xiàn)更高的DNA雙鏈切割活性。與此相符的是，Plm2Cas12e蛋白的NTSB結(jié)構(gòu)域缺乏一些和非靶標(biāo)鏈（NTS）、靶標(biāo)鏈（TS）相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基，因而在高鹽濃度的條件下表現(xiàn)出較低的雙鏈切割活性；而OpbCas12e蛋白在RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域具有一個(gè)能夠促進(jìn)R-loop形成的Helix-loop結(jié)構(gòu)，從而在高鹽濃度的條件下有相對(duì)更高的雙鏈切割活性（圖1）。這些結(jié)構(gòu)差異揭示了Cas12e家族的功能多樣性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
圖2.不同Cas12e蛋白參與解旋PAM附近雙鏈區(qū)域的結(jié)構(gòu)
最后，研究從進(jìn)化的角度描述了Cas12e家族蛋白如何通過(guò)獲得不同的結(jié)構(gòu)元件，以及相應(yīng)gRNA的多樣性來(lái)適應(yīng)多樣化的環(huán)境條件，從而提高其切割活性（圖3）。這些發(fā)現(xiàn)為未來(lái)Cas12e系統(tǒng)的優(yōu)化和基因編輯工具的開(kāi)發(fā)提供了全新思路，也對(duì)理解CRISPR-Cas系統(tǒng)的演化機(jī)制具有重要意義。
圖3. CRISPR-Cas12e家族的蛋白和引導(dǎo)RNA的進(jìn)化多樣性
在本研究中，Cas12e同源蛋白展現(xiàn)出了多樣的單鏈DNA反式切割活性，其中PlmCas12e具有最高效的反式切割活性。當(dāng)鹽濃度降低時(shí)，其活性進(jìn)一步增強(qiáng)。這些結(jié)果展現(xiàn)了Cas12e家族蛋白在核酸檢測(cè)中的巨大潛力，并為優(yōu)化其檢測(cè)性能提供了理論基礎(chǔ)。
劉俊杰副教授、陳春來(lái)副教授和蘇丁丁研究員為本文共同通訊作者；清華大學(xué)生命學(xué)院2018級(jí)博士生李丹苑、博士后張壽悅（現(xiàn)為中科院微生物研究所研究員）、2023級(jí)博士生林鑠和2018級(jí)博士生邢文婧為本文共同第一作者。清華大學(xué)生命學(xué)院2019級(jí)博士生楊韻和北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院2022級(jí)碩士生朱鳳霞也參與了研究。研究得到國(guó)家科技部腦科學(xué)項(xiàng)目、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、國(guó)家自然科學(xué)基金等的經(jīng)費(fèi)支持。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-54491-9
供稿：生命學(xué)院
編輯：李華山
審核：郭玲
