清華新聞網(wǎng)2月27日電 RNA干擾（RNAi）作為一種高度保守的RNA沉默機(jī)制，在基因表達(dá)調(diào)控、病毒感染防御以及基因組免受轉(zhuǎn)座子活性影響等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。與miRNA（micro-RNA）和exo-siRNA（exogenoussmall interfering RNA）介導(dǎo)的小RNA干擾過(guò)程相比，目前關(guān)于較長(zhǎng)且具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的endo-siRNA（endogenoussmall interfering RNA,esiRNA）的加工、成熟及其功能機(jī)制的研究相對(duì)有限。
2月20日，清華大學(xué)生命學(xué)院王宏偉課題組與復(fù)旦大學(xué)麻錦彪課題組合作，在《核酸研究》（Nucleic Aids Research）雜志上發(fā)表了題為“果蠅Dicer-2和Loqs-PD加工產(chǎn)生內(nèi)源siRNA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)”（Structural basis of endo-siRNA processing by Drosophila Dicer-2 and Loqs-PD）的研究論文。該論文通過(guò)冷凍電鏡單顆粒技術(shù)結(jié)合體外生化實(shí)驗(yàn)，闡明了果蠅Dicer-2（Dcr-2）剪切產(chǎn)生成熟esiRNA的過(guò)程及其結(jié)構(gòu)機(jī)制，并揭示了Loqs-PD在該過(guò)程中發(fā)揮的必要作用。
Dcr-2/Loqs-PD復(fù)合物加工pre-esiRNA的模型
研究團(tuán)隊(duì)以果蠅細(xì)胞中報(bào)道最多的兩種esiRNA前體（pre-esiRNA）——esi-1和esi-2為基礎(chǔ)開(kāi)展研究。在A(yíng)TP和鎂離子存在的條件下，首次獲得了Dcr-2/Loqs-PD復(fù)合物與pre-esiRNA相互作用的剪切前狀態(tài)（pre-dicing state）的高分辨結(jié)構(gòu)，并解析了分辨率更高的剪切活性狀態(tài)（dicing state）的Dcr-2/Loqs-PD/pre-esiRNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)有助于更清晰地觀(guān)測(cè)Dcr-2與底物RNA之間的相互作用關(guān)系。在剪切前狀態(tài)向剪切狀態(tài)轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，Dcr-2的Helicase和DUF283結(jié)構(gòu)域發(fā)生了明顯的構(gòu)象扭轉(zhuǎn)。雖然在剪切前狀態(tài)中pre-esiRNA到達(dá)了Platform/PAZ結(jié)構(gòu)域，但并未形成穩(wěn)定的相互作用；而在A(yíng)TP水解的驅(qū)動(dòng)下，pre-esiRNA通過(guò)Helicase結(jié)構(gòu)域繼續(xù)向上傳遞，使其3’末端進(jìn)一步移動(dòng)1nt，最終穩(wěn)定結(jié)合到PAZ結(jié)構(gòu)域的3’結(jié)合口袋中。
在沒(méi)有ATP的情況下，研究解析了Dcr-2/Loqs-PD/pre-esiRNA復(fù)合物（initial binding state）以及沒(méi)有Loqs-PD輔助時(shí)的Dcr-2/pre-esiRNA復(fù)合物（loading state）的結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，在沒(méi)有Loqs-PD存在時(shí)，pre-esiRNA雖然可以一端結(jié)合在Platform/PAZ結(jié)構(gòu)域，另一端穿過(guò)Helicase結(jié)構(gòu)域，但Dcr-2中的多個(gè)結(jié)構(gòu)域會(huì)發(fā)生顯著的構(gòu)象變化，導(dǎo)致pre-esiRNA遠(yuǎn)離RNase III結(jié)構(gòu)域，無(wú)法進(jìn)行剪切。這表明，pre-esiRNA的加工過(guò)程需要Loqs-PD的協(xié)助，才能使其結(jié)合到Dcr-2的Helicase結(jié)構(gòu)域中，從而保證剪切的順利進(jìn)行。同時(shí)，體外生化實(shí)驗(yàn)表明，Dcr-2/Loqs-PD復(fù)合物對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的pre-esiRNA的剪切是從特征閉合端開(kāi)始的，而非松散末端。該研究揭示了Dcr-2/Loqs-PD復(fù)合物對(duì)具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的pre-esiRNA加工的分子機(jī)制。
清華大學(xué)生命學(xué)院王宏偉教授、王家副研究員以及復(fù)旦大學(xué)麻錦彪教授為論文共同通訊作者，清華大學(xué)生命學(xué)院2018級(jí)博士生曹娜、王家副研究員以及復(fù)旦大學(xué)鄧婷博士為論文共同第一作者。國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（北京）、清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)、清華大學(xué)高性能計(jì)算平臺(tái)和水木未來(lái)（北京）科技有限公司為該研究提供了設(shè)備和技術(shù)支持。研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心等的支持。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1093/nar/gkaf102
供稿：生命學(xué)院
編輯：李華山
封面圖設(shè)計(jì)：賀茂藤
審核：郭玲
