清華新聞網(wǎng)3月4日電 近日，清華大學(xué)藥學(xué)院尹航課題組研究報(bào)道了首個(gè)CRBN介導(dǎo)的cGAS降解劑TH35，并探究其在潰瘍性結(jié)腸炎（UC）模型中的治療潛力，證明了cGAS靶向降解策略在安全性和有效性上相較于抑制劑的顯著性?xún)?yōu)勢(shì)。
環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷-腺苷合成酶（Cyclic GMP-AMP Synthase，cGAS）是先天免疫系統(tǒng)中識(shí)別細(xì)胞質(zhì)DNA的關(guān)鍵傳感器，主要通過(guò)識(shí)別細(xì)胞內(nèi)的雙鏈DNA（dsDNA）激活免疫反應(yīng)。然而，cGAS的過(guò)度激活會(huì)引發(fā)慢性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展，如在潰瘍性結(jié)腸炎（UC）中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，大量研究表明cGAS在UC中高度活化，抑制其激活能促進(jìn)UC的緩解和恢復(fù)，也有研究表明通過(guò)基因編輯技術(shù)體內(nèi)敲低cGAS可顯著抑制UC的進(jìn)程。因此，cGAS可作為治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在新興靶點(diǎn)。
近年來(lái)，以蛋白降解靶向嵌合體（Proteolysis-Targeting Chimeras,PROTAC）技術(shù)為代表的靶蛋白降解技術(shù)給小分子藥物開(kāi)發(fā)帶來(lái)了新的希望。在此背景下，尹航課題組提出基于PROTAC技術(shù)開(kāi)發(fā)首個(gè)cGAS降解劑，并探究其在UC小鼠模型中的抗炎活性與機(jī)制。
在cGAS PROTAC分子的設(shè)計(jì)過(guò)程中，尹航課題組選取了對(duì)人源和鼠源cGAS均具有高親和力的cGAS抑制劑G140作為靶蛋白配體，選擇了具有優(yōu)異理化性質(zhì)和藥代動(dòng)力學(xué)特征的CRBN配體（來(lái)那度胺，沙利度胺）作為E3泛素連接酶配體。隨后以cGAS與G108（與G140結(jié)構(gòu)相似的類(lèi)比物）的復(fù)合物共晶結(jié)構(gòu)為參考，對(duì)G140與cGAS進(jìn)行分子對(duì)接分析并發(fā)現(xiàn)G140中的甲基吡唑環(huán)和羥基乙?；鶊F(tuán)與G108中的相應(yīng)基團(tuán)具有相似的空間布局，均暴露于溶劑區(qū)，表明這些基團(tuán)可作為連接鏈附著的理想位點(diǎn)。隨后，研究人員引入了不同長(zhǎng)度和化學(xué)類(lèi)型的連接鏈，包括柔性基團(tuán)（如乙二醇（PEG）鏈、烷基鏈）和剛性基團(tuán)（如哌嗪環(huán)、哌啶環(huán)、炔基烷基鏈），并合成了系列PROTAC分子（TH1至TH42）。通過(guò)評(píng)估各分子的降解活性及其對(duì)cGAS通路的抑制效果，系統(tǒng)探究其構(gòu)效關(guān)系，最終確定具有最佳活性的候選分子TH35（圖1）。
圖1.新型cGAS PROTAC降解劑的設(shè)計(jì)策略
研究發(fā)現(xiàn)，TH35在THP-1和RAW 264.7細(xì)胞中以濃度依賴(lài)性方式有效降解cGAS，DC50值分別為0.9 ± 0.2 μM和4.6 ± 0.8 μM，最大降解率超過(guò)90%。質(zhì)譜分析顯示，TH35顯著降低cGAS蛋白水平，且在3852個(gè)識(shí)別蛋白中，32個(gè)蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，主要為干擾素刺激基因誘導(dǎo)的蛋白，表明TH35通過(guò)降解cGAS抑制I型干擾素反應(yīng)。回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，cGAS抑制劑G140、CRBN配體來(lái)那度胺或蛋白酶體抑制劑MG132能夠顯著逆轉(zhuǎn)TH35在THP-1細(xì)胞中的cGAS降解效應(yīng)，進(jìn)一步證明TH35通過(guò)CRBN依賴(lài)的泛素-蛋白酶體途徑誘導(dǎo)cGAS降解（圖2）。
圖2.TH35的降解活性及降解機(jī)制的研究
cGAS作為細(xì)胞質(zhì)中的DNA傳感器，能夠識(shí)別細(xì)胞內(nèi)的雙鏈DNA（dsDNA），并激活下游的STING-TBK1-IRF3信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中扮演著關(guān)鍵角色。定量質(zhì)譜分析顯示，TH35顯著降低了HT-DNA刺激下THP-1細(xì)胞中的cGAMP生成。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和Western blot分析進(jìn)一步證明，TH35以劑量依賴(lài)方式抑制HT-DNA刺激的cGAS信號(hào)傳導(dǎo)及其下游關(guān)鍵蛋白（如STING、TBK1和IRF3）的磷酸化。此外，TH35在TREX1敲除條件下依然能顯著抑制內(nèi)源性cGAS激活，且對(duì)由poly（I:C）和cGAMP刺激的IFNB表達(dá)沒(méi)有顯著影響，進(jìn)一步證明其較佳的特異性（圖3）。
圖3.TH35選擇性抑制dsDNA誘導(dǎo)cGAS通路激活的研究
進(jìn)一步細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)表明，TH35在高達(dá)60μM的濃度下對(duì)多株免疫細(xì)胞未表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性。相比之下，作為陽(yáng)性對(duì)照的G140在超過(guò)30μM的濃度下顯著誘發(fā)細(xì)胞毒性。這些結(jié)果表明，TH35相較于cGAS抑制劑G140展現(xiàn)出更為有利的體外安全性特征，具有較低的脫靶毒性（圖4）。
圖4.TH35與G140細(xì)胞毒性的評(píng)價(jià)
研究評(píng)估了TH35在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)直腸炎（UC）模型中的治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TH35在20mg/kg和50mg/kg劑量下均顯著緩解了DSS引起的小鼠體重減輕，且治療效果優(yōu)于傳統(tǒng)藥物5-ASA和cGAS抑制劑G140。此外，TH35治療顯著緩解了結(jié)腸萎縮和脾腫大現(xiàn)象，且組織學(xué)檢查顯示結(jié)腸組織病理學(xué)顯著改善，脾臟形態(tài)恢復(fù)接近正常，病理評(píng)分低于5-ASA和G140組。綜上，TH35在自身免疫疾病小鼠模型中相較于cGAS抑制劑G140具有更優(yōu)的抗炎活性（圖5）。
圖5.TH35體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)
機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，TH35在潰瘍性結(jié)腸炎（UC）小鼠模型中通過(guò)特異性降解cGAS，顯著抑制其下游信號(hào)通路，減少炎癥反應(yīng)。Western blot分析顯示，TH35治療劑量依賴(lài)性地降低了結(jié)腸中cGAS蛋白的表達(dá)水平。與5-ASA和G140相比，TH35對(duì)cGAS表達(dá)變化無(wú)顯著影響，顯示其在抗炎活性方面的不同作用機(jī)制。RT-qPCR分析進(jìn)一步表明，TH35顯著降低了結(jié)腸中多種關(guān)鍵炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。此外，TH35顯著減少了結(jié)腸組織中中性粒細(xì)胞外陷阱（NETs）的形成，表明其在抑制NETs方面的作用優(yōu)于5-ASA和G140。
圖6.TH35體內(nèi)抗炎機(jī)制研究
該研究成功設(shè)計(jì)并報(bào)道了首個(gè)CRBN介導(dǎo)的cGAS PROTAC降解劑，其在體內(nèi)外抗炎活性和安全性較cGAS抑制劑具有顯著性提升，為cGAS靶向降解治療自身免疫性疾病奠定了基礎(chǔ)。
相關(guān)研究成果以“CRBN介導(dǎo)的新型cGAS PROTAC降解劑的發(fā)現(xiàn)及其抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的研究”（Discovery of a Novel CRBN-Recruiting cGAS PROTAC Degrader for the Treatment of Ulcerative Colitis）為題，于2月26日發(fā)表于美國(guó)化學(xué)會(huì)的《藥物化學(xué)雜志》（Journal of Medicinal Chemistry）。
尹航為論文通訊作者，清華大學(xué)藥學(xué)院博士后何朋和溫成銘為論文共同第一作者。清華大學(xué)藥學(xué)院博士生張新宇為本課題作出重要貢獻(xiàn)。研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金、北京市自然科學(xué)基金、北京市卓越青年科學(xué)家項(xiàng)目、中國(guó)博士后科學(xué)基金和國(guó)家資助博士后研究人員計(jì)劃的資助。
論文鏈接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.4c02774
供稿：藥學(xué)院
編輯：李華山
封面圖設(shè)計(jì)：賀茂藤
審核：郭玲
