清華新聞網(wǎng)4月7日電 含硅有機(jī)物尤其是具有硅手性中心的化合物近年來(lái)在有機(jī)合成、功能材料及藥物化學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出重要的應(yīng)用價(jià)值，但其生物催化合成體系的發(fā)展仍顯著滯后于傳統(tǒng)化學(xué)方法。值得注意的是，盡管硅元素在地殼中的豐度高達(dá)28.8%（以二氧化硅和硅酸鹽形式存在），但是生命系統(tǒng)對(duì)其生物利用卻極為有限，僅有硅藻等少數(shù)生物進(jìn)化出特異性硅代謝途徑。研究如何利用酶催化過(guò)程制備或者轉(zhuǎn)化含硅化合物是合成化學(xué)以及生物催化領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，相關(guān)領(lǐng)域的研究已經(jīng)取得了重要進(jìn)展，其中代表性的工作如利用細(xì)胞色素c催化卡賓的硅氫鍵插入反應(yīng)，以及利用細(xì)胞色素P450酶催化惰性硅氧烷添加劑中碳硅鍵氧化降解等。相關(guān)研究充分證明了酶工程在含硅化合物的制備以及轉(zhuǎn)化方面所具備的應(yīng)用潛力，為發(fā)展綠色可持續(xù)的硅基材料合成技術(shù)開(kāi)辟了新路徑。
盡管如此，現(xiàn)有生物催化體系尚未見(jiàn)直接構(gòu)建硅手性中心的成功案例。相關(guān)研究表明，許多含硅有機(jī)物（如α-硅醇類(lèi)結(jié)構(gòu)）在水溶液中穩(wěn)定性較低，容易發(fā)生分解及消旋化。為了突破這一限制并填補(bǔ)領(lǐng)域空白，清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院劉臻課題組與浙江工業(yè)大學(xué)建筑工程學(xué)院楊云芳團(tuán)隊(duì)合作，開(kāi)發(fā)了基于P450氧化酶的去對(duì)稱(chēng)化生物催化平臺(tái)。通過(guò)蛋白質(zhì)工程改造獲得的突變體，其酶活較野生型提高了54倍，可在短時(shí)間內(nèi)完成硅烷底物的選擇性氧化，從而有效規(guī)避產(chǎn)物分解與消旋化問(wèn)題。4月3日，相關(guān)研究成員以“不對(duì)稱(chēng)合成硅立體烷醇的酶促平臺(tái)”（An Enzymatic Platform for Asymmetric Synthesis of Si-Stereogenic Silanols）為題，發(fā)表于《德國(guó)應(yīng)用化學(xué)》（Angewandte Chemie International Edition）。該研究利用源自Bacillus megaterium的野生型P450BM3酶為進(jìn)化起點(diǎn)，首次實(shí)現(xiàn)了含硅手性中心（Si-stereogeniccenter）硅醇的酶催化合成。研究人員通過(guò)六輪迭代式的定向進(jìn)化獲得了優(yōu)勢(shì)突變體ASOx-6，其催化效率（kcat/KM）較野生型提升54倍，可高效催化潛手性二氫硅烷的單氧化反應(yīng)，獲得相應(yīng)的手性硅醇產(chǎn)物。該平臺(tái)兼容多種芳基-烷基取代底物（包括含芳雜環(huán)的硅烷），模版底物的總催化轉(zhuǎn)化數(shù)（TTN）可達(dá)1450。此外，通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬以及DFT計(jì)算的手段，結(jié)合機(jī)理實(shí)驗(yàn)，研究人員系統(tǒng)闡明了該酶催化過(guò)程的反應(yīng)機(jī)制。
圖1.手性硅醇的去對(duì)稱(chēng)化合成策略
在研究的起始階段，研究人員首先對(duì)于一系列碳?xì)滏I羥化酶的硅烷氧化活性進(jìn)行了篩選評(píng)估。實(shí)驗(yàn)表明，P450氧化酶對(duì)于這一目標(biāo)反應(yīng)不僅具有顯著的初始活性以及中等的手性選擇性，更為重要的是，該催化體系中未檢測(cè)到二氫硅烷過(guò)度氧化的副產(chǎn)物硅烷二醇3a的生成?；谶@一發(fā)現(xiàn)，研究人員隨后利用野生型P450酶作為母體，進(jìn)行了多輪的定向進(jìn)化。通過(guò)針對(duì)多個(gè)活性位點(diǎn)的定點(diǎn)飽和突變（site-saturation mutagenesis）以及隨機(jī)突變（random mutagenesis），研究人員最終找到了催化這一反應(yīng)的高活性突變體ASOx-6。在僅使用0.56‰酶載量的條件下，其催化模型底物的效果為81%的收率以及90%的ee值。
圖2.關(guān)鍵酶的篩選與蛋白質(zhì)定向進(jìn)化
隨后，研究人員對(duì)于該酶催化系統(tǒng)的底物適用性進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)估。實(shí)驗(yàn)表明，多種芳基-烷基取代的二氫硅烷化合物可以被ASOx-6選擇性氧化。底物的兼容性包括芳環(huán)上不同位置與電性的取代基，或者部分含有雜環(huán)的化合物。針對(duì)部分中等收率或者較低選擇性的底物，研究人員并未展開(kāi)單獨(dú)的定向進(jìn)化，但指出基于蛋白質(zhì)工程經(jīng)驗(yàn)，可以通過(guò)類(lèi)似的進(jìn)化策略獲得針對(duì)性的突變體。
此外，放大反應(yīng)驗(yàn)證了該體系的合成潛力：分離的手性硅醇產(chǎn)物經(jīng)由鉑催化的硅氫化反應(yīng)，可立體專(zhuān)一性轉(zhuǎn)化為具有生物活性的硅醇衍生物4a以及4b。
圖3.底物適用性拓展與合成應(yīng)用探索
通過(guò)DFT計(jì)算，研究人員發(fā)現(xiàn)這一催化過(guò)程遵循與經(jīng)典碳?xì)滏I氧化體系相似的機(jī)制，包括氫原子攫?。℉ydrogen-atom abstraction）以及氧回彈（Oxygen-rebound）等關(guān)鍵反應(yīng)步驟。計(jì)算及競(jìng)爭(zhēng)性KIE實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了氫原子攫取為反應(yīng)的產(chǎn)物決定步驟，然而由于硅氫鍵的鍵能顯著低于普通的碳?xì)滏I鍵能，在這一硅烷氧化體系中，該步驟并非反應(yīng)的決速步。分子動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)比顯示：野生型P450BM3與最終變體ASOx-6的近攻擊（near-attack）構(gòu)象中，底物的pro-R氫原子均保持與鐵氧中間體較近的距離，而關(guān)鍵突變使pro-S氫在突變體中與氧中心的平均距離增加。這一變化直接決定了最終變體對(duì)于該反應(yīng)更優(yōu)的對(duì)映選擇性。
圖4.基于密度泛函理論（DFT）進(jìn)行的機(jī)理計(jì)算
總的來(lái)說(shuō)，定向進(jìn)化獲得的高效突變體ASOx-6是反應(yīng)成功的關(guān)鍵。通過(guò)開(kāi)發(fā)這一硅烷不對(duì)稱(chēng)氧化酶催化體系，研究人員證明了不穩(wěn)定手性硅醇可以通過(guò)酶催化的手段獲得，為含有硅手性中心化合物的合成提供了高效、環(huán)境友好且立體可控的生物合成策略，有望在活性分子合成及硅基材料開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域獲得應(yīng)用。
清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院研究員劉臻和浙江工業(yè)大學(xué)建筑工程學(xué)院研究員楊云芳為論文通訊作者，劉臻課題組博士生代雙玉為論文第一作者。該項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)部分主要由代雙玉完成，計(jì)算部分主要由浙江工業(yè)大學(xué)建筑工程學(xué)院陳俠荷博士完成。研究得到科技部、國(guó)家自然科學(xué)基金委、浙江省屬高?；A(chǔ)研究基金、清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院、浙江工業(yè)大學(xué)以及北京生命科學(xué)研究所的資助。
論文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/anie.202501524
供稿：生物醫(yī)學(xué)交叉研究院
編輯：李華山
審核：郭玲
