清華新聞網(wǎng)6月24日電 近日，清華大學(xué)藥學(xué)院儲(chǔ)凌課題組與深圳市第二人民醫(yī)院黃衛(wèi)人課題組合作研究開(kāi)發(fā)了一種由硅羅丹明（SiR）作為光氧化還原催化劑，在近紅外光（660nm）觸發(fā)下實(shí)現(xiàn)ONB的高效光脫籠的方法，該方法可以在體外及體內(nèi)實(shí)現(xiàn)ONB的光脫籠，為利用近紅外光實(shí)現(xiàn)生物系統(tǒng)的時(shí)空調(diào)控提供了新的工具。
研究表明，脫籠過(guò)程通過(guò)單電子轉(zhuǎn)移（SET）機(jī)制引發(fā)硝基還原，隨后發(fā)生電子級(jí)聯(lián)觸發(fā)的自消除反應(yīng)。該技術(shù)成功應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌體系。更重要的是，團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了針對(duì)非內(nèi)化性癌細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）的NIR光控前藥釋放方案，并在荷瘤小鼠模型中驗(yàn)證了其體內(nèi)應(yīng)用的有效性。
圖1. 近紅外光介導(dǎo)的ONB脫籠策略
首先，經(jīng)過(guò)對(duì)催化劑和反應(yīng)條件的系統(tǒng)篩選，確定含羧酸基團(tuán)的SiR-2為最優(yōu)催化劑。在無(wú)氧條件下，以還原劑NADH作為電子供體，該催化體系能在水環(huán)境中高效實(shí)現(xiàn)多種底物的光脫籠（表1）。該催化體系成功應(yīng)用于包括氨基酸、核苷酸、熒光探針、抗癌和抗菌藥物及生物大分子在內(nèi)的數(shù)十種底物，均展現(xiàn)出優(yōu)異的適用性。值得注意的是，傳統(tǒng)上對(duì)紫外光敏感的疊氮苯和二苯甲酮基團(tuán)，在NIR光照下也分別實(shí)現(xiàn)了99%和82%的高效脫籠，有效規(guī)避了紫外光源可能引發(fā)的副反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。
表1.近紅外光介導(dǎo)的ONB脫籠反應(yīng)的底物范圍
為驗(yàn)證在蛋白水平上的脫籠效果，研究將末端含有ONB基團(tuán)的Halo配體與Halo蛋共價(jià)結(jié)合，獲得蛋白模型復(fù)合Halo-HTL-NO?（圖2A）。高分辨質(zhì)譜分析顯示，經(jīng)NIR光照30分鐘后，復(fù)合物對(duì)應(yīng)的分子離子峰質(zhì)量數(shù)降低了133.5Da，強(qiáng)有力地證實(shí)ONB光籠基團(tuán)被成功脫除，從而釋放出Halo與其配體HTL的復(fù)合物（Halo-HTL）（圖2B）。
圖2.近紅外光介導(dǎo)的籠狀Halo-Tag蛋白的光脫籠
為闡明光催化脫籠反應(yīng)的機(jī)理，研究人員開(kāi)展了系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。對(duì)照實(shí)驗(yàn)證實(shí)，光催化脫籠反應(yīng)需同時(shí)依賴(lài)光照、催化劑SiR-2和還原劑NADH（圖3A、B）。自由基捕獲實(shí)驗(yàn)顯示，加入淬滅劑TEMPO可完全抑制反應(yīng)（圖3B），暗示自由基中間體的參與。電子轉(zhuǎn)移路徑研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)底物時(shí)，藍(lán)色反應(yīng)液光照10分鐘后褪色，停止光照后緩慢復(fù)藍(lán)；而無(wú)NADH時(shí)無(wú)此現(xiàn)象（圖3C）。吸收光譜驗(yàn)證該顏色變化源于激發(fā)態(tài)SiR-2* 被NADH還原為無(wú)色自由基（PC·?）。進(jìn)一步通過(guò)電子順磁共振（EPR）和質(zhì)譜分析直接檢測(cè)到自由基信號(hào)，HRMS鑒定出了NADH-DMPO與SiR2-DMPO加合物的生成，證實(shí)了自由基的生成。
圖3.光催化脫籠機(jī)理研究
在活細(xì)胞水平的功能驗(yàn)證進(jìn)一步彰顯了該技術(shù)的實(shí)用性。如圖4所示，在缺氧培養(yǎng)的人骨肉瘤細(xì)胞（U2OS）中，被ONB基團(tuán)淬滅的熒光探針MeRho-NO?經(jīng)SiR-2催化后熒光信號(hào)增強(qiáng)（圖4C），流式細(xì)胞術(shù)定量顯示脫籠效率達(dá)46%（圖4D）。在抗菌實(shí)驗(yàn)中，將抗菌藥甲氧芐啶（TMP）設(shè)計(jì)為前藥TMP-NO?，通過(guò)在大腸桿菌培養(yǎng)體系使用NIR光照，用于催化藥物脫籠釋放（圖4E）。
圖4.在活細(xì)胞中驗(yàn)證近紅外光催化熒光探針和抗菌藥物的脫籠
針對(duì)傳統(tǒng)抗體偶聯(lián)藥物（ADC）依賴(lài)癌細(xì)胞抗原內(nèi)吞才能釋放毒素的局限，研究構(gòu)建了靶向PD-L1抗體（Avelumab）的非內(nèi)化型ADC（MMAE-NBC-Amab）。該設(shè)計(jì)利用ONB衍生的NBC連接子橋接抗體與抗癌毒素MMAE，使其僅在NIR光照下脫籠并恢復(fù)藥物活性。在4T1乳腺癌細(xì)胞模型中，缺氧環(huán)境下使用NIR光照，結(jié)果顯示ADC治療組細(xì)胞存活率顯著降低，而黑暗對(duì)照組則無(wú)顯著毒性。
圖5.近紅外光介導(dǎo)的抗體藥物偶聯(lián)物體內(nèi)和體外光脫籠
綜上所述，研究開(kāi)發(fā)了一種基于硅羅丹明（SiR）作為光氧化還原催化劑、通過(guò)近紅外光（NIR）觸發(fā)oNB基團(tuán)脫籠的新型方法。該反應(yīng)在低氧條件下利用外源NADH作為添加劑高效進(jìn)行，具有極低的細(xì)胞毒性及廣泛的底物兼容性。
相關(guān)研究成果以“近紅外光介導(dǎo)光脫籠鄰硝基芐基基團(tuán)”（Silicon-Rhodamine-Catalyzed Near-Infrared Light-Induced Photodecaging of Ortho-Nitrobenzyl Groups In Vitro and In Vivo）為題，于6月5日發(fā)表于《美國(guó)化學(xué)會(huì)雜志》（Journal of the American Chemical Society，JACS）。
清華大學(xué)藥學(xué)院助理教授儲(chǔ)凌、深圳市第二人民醫(yī)院研究員黃衛(wèi)人為論文共同通訊作者，深圳市第二人民醫(yī)院博士后閆瀟灑為論文第一作者。清華大學(xué)藥學(xué)院杜娟娟、化學(xué)系郭興偉，上海交通大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院陳剛，中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所程靚為本文提供了重要的實(shí)驗(yàn)支持。
論文鏈接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c04942
供稿：藥學(xué)院
編輯：李華山
審核：郭玲
