清華新聞網(wǎng)7月7日電 程序性壞死是一種裂解性細(xì)胞死亡途徑，通過(guò)破壞細(xì)胞膜并釋放炎性細(xì)胞內(nèi)容物引發(fā)炎癥。多種信號(hào)通路可激活程序性壞死。RIPK1、TRIF和ZBP1均含有受體相互作用蛋白同型作用基序（RHIM），可通過(guò)此結(jié)構(gòu)域結(jié)合并激活下游蛋白R(shí)IPK3。激活的RIPK3進(jìn)一步磷酸化MLKL，形成磷酸化MLKL（pMLKL）。pMLKL對(duì)帶負(fù)電的磷脂具有親和性，其寡聚體與細(xì)胞膜負(fù)電磷脂結(jié)合并打孔，導(dǎo)致細(xì)胞膜破損及細(xì)胞死亡。有研究發(fā)現(xiàn)，程序性壞死細(xì)胞中同時(shí)存在細(xì)胞膜修復(fù)機(jī)制：膜結(jié)合的pMLKL可通過(guò)Flotillin介導(dǎo)的內(nèi)吞作用與ESCRT介導(dǎo)的外排作用被移除，從而抑制細(xì)胞膜破損。然而，細(xì)胞中累積的pMLKL是否還具有其他生物學(xué)功能，尚不清楚。
7月3日，清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院王曉東實(shí)驗(yàn)室在《分子細(xì)胞》（Molecular Cell）雜志上以封面論文形式發(fā)表了題為“MLKL在誘導(dǎo)壞死下垂時(shí)通過(guò)釋放線(xiàn)粒體DNA激活cGAS-STING通路”（MLKL activates the cGAS-STING pathway by releasing mitochondrial DNA upon necroptosis induction）的研究。研究發(fā)現(xiàn)，在程序性壞死細(xì)胞中，I型干擾素表達(dá)上調(diào)，其中Ifnb上升最為顯著。敲除程序性壞死關(guān)鍵蛋白R(shí)IPK1、RIPK3或MLKL可完全抑制Ifnb表達(dá)，且此效應(yīng)獨(dú)立于細(xì)胞膜破損。
細(xì)胞內(nèi)Ifnb表達(dá)主要依賴(lài)于TBK1-IRF3信號(hào)軸的激活。在該程序性壞死體系中，可能有兩種途徑激活TBK1：第一，RIG-I/MDA5識(shí)別胞質(zhì)雙鏈RNA后，通過(guò)下游MAVS蛋白激活TBK1；第二，cGAS識(shí)別胞質(zhì)雙鏈DNA后，通過(guò)STING激活TBK1。研究人員發(fā)現(xiàn)，敲除MAVS不影響Ifnb表達(dá)，而敲除cGAS則顯著降低Ifnb表達(dá)。進(jìn)一步敲低cGAS下游蛋白STING或TBK1雖不影響程序性壞死進(jìn)程，但均能抑制Ifnb表達(dá)。這些結(jié)果表明，程序性壞死細(xì)胞中Ifnb表達(dá)上調(diào)是由cGAS-STING信號(hào)通路激活介導(dǎo)的。
cGAS是胞質(zhì)游離雙鏈DNA感受器，可識(shí)別病毒、線(xiàn)粒體或核基因組來(lái)源的DNA。為探究程序性壞死中何種DNA激活了cGAS，研究人員分離了細(xì)胞的胞質(zhì)組分（cytosol）。qPCR檢測(cè)顯示，胞質(zhì)中游離的核基因組DNA含量基本不變，而線(xiàn)粒體DNA（mtDNA）含量顯著增加。免疫熒光結(jié)合超分辨成像顯示，誘導(dǎo)程序性壞死后，mtDNA從線(xiàn)粒體內(nèi)部移出至線(xiàn)粒體外或限制于線(xiàn)粒體外膜。在線(xiàn)粒體DNA缺失的ρ0細(xì)胞中，程序性壞死仍能發(fā)生，但由于缺乏胞質(zhì)游離mtDNA，Ifnb表達(dá)被抑制。
多種線(xiàn)粒體應(yīng)激壓力可導(dǎo)致mtDNA釋放，例如線(xiàn)粒體內(nèi)核酸酶EndoG缺失或mtDNA結(jié)合蛋白TFAM缺失等。然而程序性壞死細(xì)胞中這些蛋白并未減少。mtDNA釋放的可能途徑包括線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）、VDAC寡聚化孔、Gasdermin家族蛋白或Bax/Bak等。但mPTP和VDAC寡聚化的抑制劑均不能抑制此mtDNA釋放。由于程序性壞死誘導(dǎo)體系中Z-VAD-fmk的存在，Gasdermin不會(huì)被切割活化。Bax/Bak雙敲除細(xì)胞也不能抑制程序性壞死中的mtDNA釋放。最終，研究人員確定寡聚的pMLKL是執(zhí)行mtDNA釋放的關(guān)鍵。pMLKL寡聚化抑制劑13172可抑制mtDNA釋放。在線(xiàn)粒體膜開(kāi)口處也觀(guān)察到了pMLKL的共定位。在純化的線(xiàn)粒體組分中檢測(cè)到pMLKL富集。線(xiàn)粒體膜富含帶負(fù)電的心磷脂，而MLKL對(duì)心磷脂具有高親和性。PLSCR3是負(fù)責(zé)將心磷脂從線(xiàn)粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)至外膜的翻轉(zhuǎn)酶，其缺失可抑制程序性壞死導(dǎo)致的mtDNA釋放。
圖1.寡聚pMLKL定位于線(xiàn)粒體外膜開(kāi)口
為探究mtDNA釋放過(guò)程是否受調(diào)控，研究人員通過(guò)小規(guī)?；衔锖Y選發(fā)現(xiàn)微管完整性起關(guān)鍵作用。穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)的小分子不影響mtDNA釋放，而破壞微管結(jié)構(gòu)的小分子則顯著抑制其釋放。免疫熒光結(jié)果顯示，微管結(jié)構(gòu)破壞后，程序性壞死細(xì)胞內(nèi)的線(xiàn)粒體雖發(fā)生分裂，但mtDNA仍被線(xiàn)粒體外膜包裹，不會(huì)釋放到胞質(zhì)。然而微管結(jié)構(gòu)的完整性并不影響pMLKL在線(xiàn)粒體上的富集。
部分極早發(fā)性炎癥性腸?。↖BD）患者因Caspase8蛋白表達(dá)降低而導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞發(fā)生程序性壞死。研究人員構(gòu)建了腸上皮特異性誘導(dǎo)敲除Caspase8的小鼠模型。注射他莫昔芬誘導(dǎo)后，小鼠出現(xiàn)腸炎癥狀，包括腸上皮損傷、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和腸上皮杯狀細(xì)胞減少等。在腸上皮細(xì)胞中同時(shí)敲除RIPK3或MLKL，可完全抑制由程序性壞死引發(fā)的腸炎癥狀。透射電鏡在腸上皮細(xì)胞中觀(guān)察到破損的線(xiàn)粒體，分離的腸上皮細(xì)胞胞質(zhì)中游離mtDNA也顯著增加。熒光原位雜交顯示IBD小鼠腸上皮中Ifnb表達(dá)顯著升高，干擾素刺激基因產(chǎn)物IFI44蛋白水平也增加。注射STING抑制劑H-151可降低腸上皮細(xì)胞中Ifnb表達(dá)和IFI44蛋白水平，減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，并加速炎癥消退。
圖2.IBD腸上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體破損伴隨Ifnb表達(dá)增加
圖3.程序性壞死細(xì)胞激活自身Ifnb表達(dá)的機(jī)制
綜上，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在程序性壞死過(guò)程中，pMLKL除了破壞細(xì)胞膜外，還會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜破損并釋放mtDNA，進(jìn)而激活cGAS-STING通路，誘導(dǎo)Ifnb表達(dá)。在程序性壞死誘發(fā)的小鼠IBD模型中，STING抑制劑能加速腸道炎癥消退。該研究深化了對(duì)程序性壞死的理解，并對(duì)IBD治療具有積極意義。
清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院王曉東實(shí)驗(yàn)室的丁璋誠(chéng)博士為論文第一作者，王曉東研究員為論文通訊作者。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2025.06.005
供稿：生物醫(yī)學(xué)交叉研究院
編輯：李華山
圖片設(shè)計(jì)：賀茂藤
審核：郭玲
