清華新聞網(wǎng)7月22日電 熒光探針是活細(xì)胞成像與生物分子動(dòng)態(tài)研究的核心工具。近年來(lái)，染料-自標(biāo)簽蛋白（self-labeling protein tags, SLPs）因其高度的通用性和靈活的染料適配性，成為超分辨成像、單分子檢測(cè)、膜電位記錄等先進(jìn)成像技術(shù)中的關(guān)鍵組件。然而，染料在長(zhǎng)時(shí)間成像中仍面臨光漂白這一“老問(wèn)題”，而此前相關(guān)優(yōu)化幾乎均集中于染料本身的化學(xué)修飾，蛋白質(zhì)微環(huán)境對(duì)染料帶來(lái)的影響很少受到關(guān)注。
7月18日，北京大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心，膜生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陳知行課題組與清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心，膜生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陳春來(lái)課題組，合作在《美國(guó)科學(xué)院院報(bào)》（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）在線(xiàn)發(fā)表了題為“通用硫醚編輯策略增強(qiáng)自標(biāo)記標(biāo)簽上羅丹明的光穩(wěn)定性”（Thioether editing generally increases the photostability of rhodamine dyes on self-labeling tags）的最新合作研究成果。
研究團(tuán)隊(duì)前期的工作發(fā)現(xiàn)，鄰近硫醚基團(tuán)的存在會(huì)顯著降低染料的光穩(wěn)定性。對(duì)于目前廣泛應(yīng)用的三類(lèi)SLPs而言，SNAP-tag和TMP-tag3在共價(jià)結(jié)合過(guò)程中均會(huì)在染料附近生成硫醚基團(tuán)，而HaloTag的共價(jià)反應(yīng)不產(chǎn)生硫醚。已有研究指出，對(duì)于同一羅丹明染料在HaloTag體系中的光穩(wěn)定性往往優(yōu)于在SNAP-tag中的表現(xiàn)。研究團(tuán)隊(duì)推測(cè)，這種差異可能部分源于SNAP-tag和TMP-tag3所固有的硫醚基團(tuán)帶來(lái)的負(fù)面影響。
為進(jìn)一步研究硫醚基團(tuán)對(duì)羅丹明染料光穩(wěn)定性的影響，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)單分子熒光實(shí)驗(yàn)定量比較了同一羅丹明染料分子在三種標(biāo)簽系統(tǒng)中的光穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)HaloTag系統(tǒng)往往優(yōu)于SNAP-tag和TMP-tag3，染料發(fā)射的總光子數(shù)可以有2~3倍的差異（圖1）。更進(jìn)一步的，研究團(tuán)隊(duì)利用不同的巰基生物偶聯(lián)策略和臨近位置Met殘基突變的方式，驗(yàn)證了硫醚基團(tuán)在SLPs中對(duì)光穩(wěn)定性的重要影響。
圖1 單分子熒光定量表征羅丹明染料在不同自標(biāo)記標(biāo)簽上的光穩(wěn)定性
基于這一發(fā)現(xiàn)，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步提出“硫醚編輯”策略——降低或消除熒光染料附近的“硫醚效應(yīng)”可以顯著提升染料的光穩(wěn)定性。在驗(yàn)證了HaloTag系統(tǒng)中硫醚對(duì)于羅丹明類(lèi)染料光穩(wěn)定性的影響后，研究團(tuán)隊(duì)篩選出HaloTag: M175L突變體作為對(duì)于羅丹明類(lèi)染料廣泛適用的高光穩(wěn)定性成像平臺(tái)，并將其應(yīng)用在了電壓成像和結(jié)構(gòu)光照明（SIM）超分辨成像中（圖2），顯著延長(zhǎng)了高質(zhì)量活細(xì)胞熒光成像時(shí)間。
圖2 HaloTag-M175L在電壓和SIM成像中改善羅丹明染料的光穩(wěn)定性
研究團(tuán)隊(duì)在多種細(xì)胞成像條件下觀(guān)察到，M175與M175L之間的光漂白速率差異在初始階段顯著高于后續(xù)階段，這可能源自不同階段下不同的光化學(xué)機(jī)理。在前面的工具開(kāi)發(fā)中，M175已經(jīng)被證明為是HaloTag中可以提升光穩(wěn)定性的關(guān)鍵位點(diǎn)。為進(jìn)一步研究其背后的化學(xué)機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)與Kai Johnsson課題組的Julian Kompa展開(kāi)合作，利用可交換HaloTag工具，對(duì)染料-蛋白復(fù)合體的光照過(guò)程進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜監(jiān)測(cè)。發(fā)展在染料被激發(fā)的條件下，HaloTag中的Met175發(fā)生了特征性的氧化。據(jù)此，研究團(tuán)隊(duì)推測(cè)，對(duì)于廣泛應(yīng)用于活細(xì)胞成像的HaloTag，其M175的存在導(dǎo)致了成像前期光漂白的加速；而后期，由于M175中的硫醚基團(tuán)被氧化為亞砜或砜，使得硫醚效應(yīng)不復(fù)存在，從而使得光漂白的后期不受到硫醚效應(yīng)的干擾，進(jìn)而減緩了光漂白速率（圖3）。
圖3 質(zhì)譜驗(yàn)證M175在染料光漂白過(guò)程中的關(guān)鍵化學(xué)機(jī)制
綜上，本研究提出染料微環(huán)境中的“硫醚效應(yīng)”廣泛影響了細(xì)胞成像中的光穩(wěn)定性并部分帶來(lái)了不同SLPs中的光穩(wěn)定性差異。并且，這一影響往往主要集中于成像的前期，成像的后期由于硫醚光氧化過(guò)程而逐漸被抑制。應(yīng)用“硫醚編輯”策略，研究團(tuán)隊(duì)優(yōu)選了HaloTag：M175L突變體，這一SLP蛋白質(zhì)標(biāo)簽可顯著提升多種羅丹明染料的光穩(wěn)定性，從而助力活細(xì)胞成像和超分辨顯微成像，并拓展了熒光分子微環(huán)境調(diào)控染料性質(zhì)的研究維度。
北京大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合中心2019級(jí)博士生凌靖（已畢業(yè)）、北京大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院2019級(jí)博士生張?jiān)矗ㄒ旬厴I(yè)）、清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2017級(jí)博士生黑永朕（已畢業(yè)）為本文的共同第一作者。北京大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心陳知行副教授，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳春來(lái)副教授和張?jiān)床┦繛楸疚牡墓餐ㄓ嵶髡?。德?guó)馬普所2021級(jí)博士生Julian Kompa和Kai Johnsson教授對(duì)于機(jī)理探索提供了重要證據(jù)。清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院已出站博士后楊辰博士進(jìn)行了重要的前期探索工作。北京大學(xué)李毓龍教授、鄧伍蘭研究員、鄒鵬副教授共同參與了該項(xiàng)研究工作。北京大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合中心2020級(jí)博士生王波、北京大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院博士后張鈞維、北京大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院2024級(jí)博士生杜佳晟、德國(guó)馬普所Tatjana Rudi、北京大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院2020級(jí)博士生（已畢業(yè)）張珂誠(chéng)、清華大學(xué)細(xì)胞影像平臺(tái)主管王文娟工程師、德國(guó)馬普所Sebastian Fabritz對(duì)文章作出了重要貢獻(xiàn)。
論文鏈接：
www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2426354122
供稿：生命學(xué)院
編輯：贠爾茹
審核：周襄楠
