清華新聞網(wǎng)9月11日電 軸手性（Atropisomerism）是一類(lèi)因單鍵旋轉(zhuǎn)受限而形成的穩(wěn)定立體異構(gòu)體，其構(gòu)型穩(wěn)定性主要取決于旋轉(zhuǎn)勢(shì)壘及空間位阻效應(yīng)。這類(lèi)化合物廣泛存在于天然產(chǎn)物、藥物分子以及手性配體和有機(jī)小分子催化劑中。如何高效且選擇性地構(gòu)建軸手性化合物，一直是合成化學(xué)和生物催化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
軸手性化合物的對(duì)映選擇性合成主要有兩種策略：一種是基于已有的（潛）手性軸，通過(guò)天然酶催化的不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)化（如動(dòng)力學(xué)拆分）來(lái)實(shí)現(xiàn)手性軸的選擇性構(gòu)建；第二種方法則是直接構(gòu)建新的手性軸。盡管相關(guān)研究已取得重要進(jìn)展，但總體而言，生物催化在軸手性骨架的構(gòu)建方面仍局限于少數(shù)的逆合成策略和反應(yīng)類(lèi)型，與化學(xué)合成方法相比仍存在較大差距。
9月10日，清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院劉臻實(shí)驗(yàn)室與黃牛團(tuán)隊(duì)合作，在《自然·合成》（Nature Synthesis）雜志發(fā)表了題為“分子動(dòng)力學(xué)模擬引導(dǎo)下黃酮類(lèi)酶的定向進(jìn)化”（Molecular-dynamics-simulation-guided directed evolution of flavoenzymes for atroposelective desaturation）的研究論文。該研究報(bào)道了一種基于定向進(jìn)化策略開(kāi)發(fā)的創(chuàng)新性生物催化方法，研究團(tuán)隊(duì)利用來(lái)源于Parageobacillus thermantarcticus的黃素酶PtOYE，通過(guò)工程化改造獲得了具有對(duì)映選擇性去飽和活性的變體，從而實(shí)現(xiàn)了軸手性聯(lián)芳基化合物的高效合成。值得一提的是，分子動(dòng)力學(xué)模擬（MD simulation）在定向進(jìn)化進(jìn)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，該技術(shù)揭示了催化反應(yīng)過(guò)程中酶的潛在構(gòu)象變化，并在此基礎(chǔ)上識(shí)別出此前在PtOYE及其同類(lèi)酶中未被發(fā)現(xiàn)的重要?dú)埢?。以此為指?dǎo)獲得的工程化酶ADes-5相較于初始變體（PtOYE-Y28F），其催化效率（kcat/KM）提升了70倍以上。
此外，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)X射線(xiàn)晶體學(xué)手段解析了ADes-5的結(jié)構(gòu)（PDB：9IUV），確定了其活性中心和整體的結(jié)構(gòu)特征。該工程化酶能夠?qū)⒍喾N1-芳基-2-四氫萘酮底物以很高的收率和良好的對(duì)映選擇性轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的聯(lián)芳基產(chǎn)物，進(jìn)一步的衍生反應(yīng)展示了合成產(chǎn)物在多官能團(tuán)軸手性分子構(gòu)建中的廣泛應(yīng)用潛力。
圖1.軸手性化合物的生物催化策略
為提高篩選效率，研究團(tuán)隊(duì)采用了MD模擬指導(dǎo)的蛋白質(zhì)工程策略。研究團(tuán)隊(duì)首先基于A(yíng)lphaFold2預(yù)測(cè)的ADes-1結(jié)構(gòu)以及PtOYE的催化機(jī)制，將底物1a的兩種對(duì)映體分別對(duì)接至酶的活性口袋中。其中R構(gòu)型由于在對(duì)接過(guò)程中與活性位點(diǎn)存在嚴(yán)重空間位阻而被排除；而（S）-1a存在兩種可能的結(jié)合模式，這兩種結(jié)合模式的主要差異存在于萘環(huán)取向：在Conf-I模式中，底物甲氧基朝向活性位點(diǎn)外側(cè)；Conf-II模式中，底物甲氧基朝向活性位點(diǎn)內(nèi)側(cè)并與S249和R215形成相互作用（圖2b）。
研究團(tuán)隊(duì)在此基礎(chǔ)上對(duì)兩種結(jié)合模式的復(fù)合物結(jié)構(gòu)分別進(jìn)行了MD模擬，模擬結(jié)果顯示在Conf-II模式中，隨著底物分子的結(jié)合，PtOYE蛋白發(fā)生了顯著的構(gòu)象變化：Loop I和Loop II之間的“鎖扣”結(jié)構(gòu)打開(kāi)，同時(shí)Loop I向內(nèi)關(guān)閉穩(wěn)定了底物結(jié)合（圖2d）；而在Conf-I模式的MD結(jié)果中，未觀(guān)察到類(lèi)似的構(gòu)象變化，同時(shí)底物分子結(jié)合不穩(wěn)定（圖2c）。MD模擬說(shuō)明了Conf-II模式的合理性以及構(gòu)象變化在穩(wěn)定底物結(jié)合過(guò)程中的重要性，揭示了PtOYE催化底物反應(yīng)的潛在結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)機(jī)制。
對(duì)模擬結(jié)果中的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步可視化分析表明：第一，在初始構(gòu)象中，Loop II上的F124與LoopI上的P255和A252通過(guò)疏水相互作用形成“鎖扣”結(jié)構(gòu)，限制了Loop I的閉合；第二，在最終的Loop I“閉合”構(gòu)象中，疏水殘基V254靠近底物并形成新的相互作用（圖2d）?；谶@些結(jié)構(gòu)與動(dòng)態(tài)信息，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)F124、V254和P255三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了位點(diǎn)飽和突變篩選，旨在打破“鎖扣”構(gòu)象并穩(wěn)定“閉合”構(gòu)象，從而促進(jìn)底物的結(jié)合和催化。篩選得到的F124Q與V254F變體分別對(duì)反應(yīng)收率提升了3.8倍和3.4倍，二者組合后得到的雙突變體ADes-4，使產(chǎn)率提升至50%，對(duì)映選擇性達(dá)到88% e.e.。進(jìn)一步在A(yíng)252位點(diǎn)進(jìn)行突變和篩選，獲得了催化性能最優(yōu)的ADes-5，其產(chǎn)率高達(dá)98%，對(duì)映選擇性為89% e.e.，和初始變體ADes-1相比，產(chǎn)率提升了45倍。
圖2.分子動(dòng)力學(xué)模擬指導(dǎo)的定向進(jìn)化
為深入理解蛋白質(zhì)工程對(duì)于軸手性脫氫酶性能的影響，研究團(tuán)隊(duì)測(cè)定了進(jìn)化譜系中四個(gè)ADes變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)124Q和V254F兩個(gè)突變顯著提高了酶的催化活性，使ADes-4的催化速率（kcat）和ADes-1相比提高了26倍，同時(shí)表現(xiàn)出更低的KM值，表明底物親和力增強(qiáng)。最終獲得的ADes-5變體展現(xiàn)出最優(yōu)的催化性能，其催化效率kcat/KM較初始變體提升了70倍。這些觀(guān)察結(jié)果與研究團(tuán)隊(duì)基于MD模擬所建立的機(jī)制模型相一致。
圖3.ADes變體動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定
在確定最優(yōu)變體ADes-5后，研究團(tuán)隊(duì)評(píng)估了其在多種1-芳基-2-四氫萘酮衍生物上的適用性。結(jié)果表明該酶對(duì)芳環(huán)的各種取代基都表現(xiàn)出顯著的耐受性，無(wú)論是鹵素、雜環(huán)還是氧化敏感的底物，均可被高效轉(zhuǎn)化為目標(biāo)聯(lián)芳基產(chǎn)物，且具有良好的產(chǎn)率與對(duì)映選擇性。
圖4.酶催化反應(yīng)底物的拓展
圖5.制備級(jí)規(guī)模的放大和產(chǎn)物的衍生化
綜上所述，這項(xiàng)工作證明了黃素依賴(lài)的脫氫酶可以用于軸手性分子的合成，擴(kuò)大了這類(lèi)酶的已知用途。同時(shí)，MD模擬有效預(yù)測(cè)了催化反應(yīng)過(guò)程中酶的構(gòu)象變化，并識(shí)別出以前在PtOYE和相關(guān)酶中未識(shí)別的重要?dú)埢砻魍ㄟ^(guò)調(diào)控柔性loop的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)可有效調(diào)節(jié)酶的催化活性，這一策略也為其他與生物催化轉(zhuǎn)化相關(guān)的蛋白質(zhì)體系的設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供了重要參考。
劉臻實(shí)驗(yàn)室2022級(jí)博士生尹紅寧和黃牛實(shí)驗(yàn)室博士后陳釗為論文共同第一作者；劉臻研究員和黃牛研究員為論文通訊作者。研究得到科技部、清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院以及北京生命科學(xué)研究所的資助。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s44160-025-00882-9
供稿：生物醫(yī)學(xué)交叉研究院
編輯：李華山
審核：郭玲
