清華新聞網(wǎng)9月19日電 哺乳動(dòng)物大腦是由海量異質(zhì)性神經(jīng)元相互連接構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，解析其組織規(guī)則與功能連接必須進(jìn)行高分辨率神經(jīng)元重構(gòu)。介觀(guān)層面（mesoscale，即細(xì)胞水平）實(shí)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)精準(zhǔn)重構(gòu)，是目前解析大型復(fù)雜神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的最可行且最具前景的途徑。當(dāng)前，介觀(guān)層面的單神經(jīng)元重構(gòu)主要依賴(lài)熒光蛋白標(biāo)記結(jié)合切片式亞微米級(jí)光學(xué)成像。
9月18日，清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院林睿實(shí)驗(yàn)室與北京腦科學(xué)與類(lèi)腦研究所羅敏敏實(shí)驗(yàn)室在《神經(jīng)元》（Neuron）在線(xiàn)發(fā)表了題為“超亮化學(xué)標(biāo)記實(shí)現(xiàn)大組織樣本中的快速神經(jīng)連接分析”（Ultrabright Chemical Labeling Enables Rapid Neural Connectivity Profiling in Large Tissue Samples）的研究文章，提出了一種高亮的小鼠全腦/全身神經(jīng)元快速化學(xué)熒光標(biāo)記方法LINCS（Labeling Individual Neurons with Chemical dyes and Controllable Sparseness）。
LINCS利用鄰近標(biāo)記（proximity labeling）方法，通過(guò)結(jié)合Cre依賴(lài)型AAV與特定Cre轉(zhuǎn)基因小鼠品系在神經(jīng)元中表達(dá)可溶性增強(qiáng)型工程化生物素連接酶（solubility-enhanced TurboID, seTurboID），并為小鼠提供生物素飲水。生物素?cái)U(kuò)散入細(xì)胞后被seTurboID催化，共價(jià)標(biāo)記至胞內(nèi)蛋白，完成神經(jīng)元的高效在體生物素化（圖1）。隨后，LINCS通過(guò)熒光染料偶聯(lián)的鏈霉親和素（Streptavidin）進(jìn)行全腦染色，將生物素標(biāo)記轉(zhuǎn)化為熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞類(lèi)型和神經(jīng)環(huán)路特異性的靶向神經(jīng)元標(biāo)記。
在開(kāi)發(fā)過(guò)程中，研究人員解決了兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題。首先，研究人員將TurboID與促溶標(biāo)簽GB1融合改造為seTurboID，使其在神經(jīng)元胞體及長(zhǎng)距離投射末端的表達(dá)顯著增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)生物素標(biāo)記沿長(zhǎng)軸突神經(jīng)元的完整覆蓋（圖1）。其次，研究人員發(fā)現(xiàn)野生型鏈霉親和素（四聚體，含四個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)）在大組織樣品染色中存在組織滲透性差和非特異性血管結(jié)合高等問(wèn)題。研究人員通過(guò)應(yīng)用經(jīng)過(guò)工程化改造、僅保留一個(gè)活性結(jié)合位點(diǎn)的單價(jià)鏈霉親和素（monovalent Streptavidin），徹底解決了深層穿透障礙和非特異性結(jié)合問(wèn)題，并仍然維持與生物素分子結(jié)合的高親和力與穩(wěn)定性（圖2）。
圖1.LINCS原理設(shè)計(jì)
通過(guò)將seTurboID在體標(biāo)記、單價(jià)鏈霉親和素染色和DISCO有機(jī)相透明化技術(shù)相結(jié)合，研究人員成功建立了LINCS全流程（圖2）。LINCS僅需三周的seTurboID表達(dá)聯(lián)合三天的染色即可完成樣品制備（染色+透明化步驟僅需約一周）。同時(shí)，LINCS樣本還具備更亮、更均勻的信號(hào)特性，并能處理大體積樣品（圖2），成功實(shí)現(xiàn)了在小鼠完整大腦-脊髓樣品內(nèi)對(duì)皮質(zhì)脊髓束神經(jīng)元的標(biāo)記，同時(shí)通過(guò)心臟灌流實(shí)現(xiàn)對(duì)成年小鼠全身外周神經(jīng)元的染色標(biāo)記。此外，LINCS還可兼容膨脹顯微鏡（Expansion Microscopy），并可與iDISCO+抗體染色聯(lián)用實(shí)現(xiàn)多重標(biāo)記。
圖2.LINCS在大體積組織樣品中實(shí)現(xiàn)快速高亮神經(jīng)元標(biāo)記
為實(shí)現(xiàn)全腦單神經(jīng)元重構(gòu)，研究人員將LINCS與多種稀疏標(biāo)記策略整合，包括團(tuán)隊(duì)前期開(kāi)發(fā)的雙AAV稀疏標(biāo)記系統(tǒng)（dual-AAV sparse labeling）以及本工作新開(kāi)發(fā)的基于CRISPR/Cas9介導(dǎo)Cre基因敲除的穩(wěn)定稀疏標(biāo)記系統(tǒng)（Cre-KO sparse labeling）。
圖3.基于LINCS的全腦單神經(jīng)元重構(gòu)方案
綜上，LINCS通過(guò)創(chuàng)新性的結(jié)合工程化seTurboID與單價(jià)鏈霉親和素，突破了現(xiàn)有方案在標(biāo)記速度、信號(hào)強(qiáng)度與均勻性以及組織穿透性上的核心瓶頸。LINCS流程可適配從全腦到全身的跨尺度樣本，并兼容多模態(tài)技術(shù)，為神經(jīng)元連接組學(xué)研究提供了高效、穩(wěn)定、易用且可擴(kuò)展的解決方案。
清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院林睿實(shí)驗(yàn)室博士后鐘詩(shī)琳為論文第一作者，林睿博士與北京腦科學(xué)與類(lèi)腦研究所羅敏敏博士為論文共同通訊作者。
研究得到科技部科技創(chuàng)新2030-腦科學(xué)與類(lèi)腦研究項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金、北京市科技新星計(jì)劃、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)創(chuàng)新單元、新基石研究員項(xiàng)目和北京市政府的資助。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.neuron.2025.08.022
供稿：生物醫(yī)學(xué)交叉研究院
編輯：李華山
審核：郭玲
