清華新聞網(wǎng)11月7日電 三維基因組結(jié)構(gòu)與表觀(guān)遺傳修飾是調(diào)控基因表達(dá)的重要機(jī)制，其動(dòng)態(tài)變化與發(fā)育、細(xì)胞命運(yùn)決定及癌癥等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。測(cè)序技術(shù)與固定細(xì)胞熒光原位雜交（Fluorescencein situ hybridization, FISH）等方法極大推動(dòng)了三維基因組互作的研究，但這些方法多依賴(lài)固定樣本，難以反映染色質(zhì)在活細(xì)胞中的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化。實(shí)現(xiàn)基因組在活細(xì)胞內(nèi)的時(shí)空可視化是理解基因調(diào)控動(dòng)態(tài)的關(guān)鍵?，F(xiàn)有基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的活細(xì)胞成像技術(shù)雖能靶向內(nèi)源基因序列，但在非重復(fù)序列標(biāo)記、多位點(diǎn)同時(shí)成像及原代細(xì)胞應(yīng)用方面仍存在靈敏度不足、系統(tǒng)復(fù)雜度高等難點(diǎn)。
11月6日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王海峰課題組、頡偉課題組與中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所方顯楊課題組在《自然·生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）在線(xiàn)發(fā)表題為“基于CRISPR的活細(xì)胞成像研究非重復(fù)基因位點(diǎn)的染色質(zhì)動(dòng)態(tài)及增強(qiáng)子互作”（CRISPR live-cell imaging reveals chromatin dynamics and enhancer interactions at multiple non-repetitive loci）的研究論文。研究創(chuàng)新性地將CRISPR技術(shù)與拓展遺傳密碼技術(shù)相結(jié)合，研發(fā)出新型活細(xì)胞多色DNA成像技術(shù)——CRISPR PRO-LiveFISH（Pooled gRNAs with Orthogonal bases LiveFISH），實(shí)現(xiàn)了在活細(xì)胞中對(duì)非重復(fù)DNA序列的高靈敏度、多通道實(shí)時(shí)成像，并探索了表觀(guān)修飾、增強(qiáng)子互作與染色質(zhì)動(dòng)態(tài)之間的調(diào)控規(guī)律。
研究團(tuán)隊(duì)在此前CRISPR LiveFISH技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了系統(tǒng)性升級(jí)，首次在CRISPR系統(tǒng)的引導(dǎo)RNA（sgRNA）標(biāo)記中引入拓展遺傳字母表中的正交非天然堿基對(duì)（unnatural base pairs, UBPs），結(jié)合Cas9/sgRNA結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的理性設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了位點(diǎn)特異性的sgRNA熒光標(biāo)記，顯著提升了染色質(zhì)活細(xì)胞成像的靈敏度和信噪比。PRO-LiveFISH可同時(shí)實(shí)現(xiàn)多達(dá)六個(gè)基因位點(diǎn)的多色動(dòng)態(tài)觀(guān)測(cè)，在無(wú)需信號(hào)放大的情況下，僅使用約十條sgRNA可有效標(biāo)記非重復(fù)基因位點(diǎn)，適用于包括原代細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類(lèi)型。
CRISPR PRO-LiveFISH的設(shè)計(jì)策略及應(yīng)用
利用PRO-LiveFISH技術(shù)，研究團(tuán)隊(duì)成功實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)多基因位點(diǎn)的動(dòng)態(tài)觀(guān)測(cè)，系統(tǒng)探索了表觀(guān)修飾和染色質(zhì)互作相關(guān)的動(dòng)態(tài)調(diào)控規(guī)律。首先，通過(guò)比較不同細(xì)胞狀態(tài)、不同細(xì)胞類(lèi)型中同一基因位點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)行為，發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)運(yùn)動(dòng)狀態(tài)與其表觀(guān)修飾水平密切相關(guān)：活躍的組蛋白修飾（如乙?；┏０殡S著受限的位點(diǎn)運(yùn)動(dòng)，而乙酰化水平下降則伴隨更高的位點(diǎn)動(dòng)態(tài)。通過(guò)對(duì)特定增強(qiáng)子及其靶基因進(jìn)行同步動(dòng)態(tài)標(biāo)記，研究發(fā)現(xiàn)它們?cè)趧?dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)中依然能保持持續(xù)的空間鄰近，說(shuō)明這一基因位點(diǎn)的增強(qiáng)子-啟動(dòng)子（E-P）互作在時(shí)空維度上具有相對(duì)穩(wěn)定性。最后，通過(guò)對(duì)超級(jí)增強(qiáng)子及其靶基因的追蹤，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄共激活因子BRD4在維持此類(lèi)三維互作中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)BRD4活性受到抑制時(shí)，超級(jí)增強(qiáng)子及其靶基因的空間距離顯著增加，表明了相應(yīng)的三維互作的解離。這些發(fā)現(xiàn)從動(dòng)態(tài)視角闡釋了轉(zhuǎn)錄共激活因子BRD4對(duì)三維基因組的調(diào)控機(jī)制。
綜上， CRISPR PRO-LiveFISH通過(guò)結(jié)合拓展遺傳字母技術(shù)與sgRNA理性設(shè)計(jì)，為動(dòng)態(tài)三維基因組研究提供了靈活高效的活細(xì)胞多色成像平臺(tái)。該技術(shù)不僅適用于非重復(fù)DNA序列的動(dòng)態(tài)標(biāo)記，也可應(yīng)用于原代細(xì)胞增強(qiáng)子-啟動(dòng)子互作的標(biāo)記。 借助該工具，研究團(tuán)隊(duì)探索了染色質(zhì)動(dòng)態(tài)與表觀(guān)遺傳之間的相互關(guān)聯(lián)、解析了增強(qiáng)子-啟動(dòng)子互作的時(shí)空特性，并闡釋了轉(zhuǎn)錄共激活因子BRD4在維持超級(jí)增強(qiáng)子三維互作中的關(guān)鍵作用，從而深化了對(duì)表觀(guān)調(diào)控和三維基因組時(shí)空動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制的理解。
清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究員王海峰、教授頡偉以及中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所研究員方顯楊為論文共同通訊作者。清華大學(xué)生命學(xué)院2019級(jí)博士生劉美鑠、2022級(jí)博士生黃可韻和2025屆博士畢業(yè)生張杰為論文共同第一作者。西湖大學(xué)教授于洪濤、研究員戚樹(shù)濤，清華大學(xué)博士后杜振海（現(xiàn)為中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心研究員），以及清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2024屆博士畢業(yè)生胡梁俊、2021級(jí)博士生李青陽(yáng)、2022級(jí)博士生王新銘、2021級(jí)博士生顧卜銘、2023級(jí)博士生唐昊、2021級(jí)博士生馬宇等對(duì)研究作出重要貢獻(xiàn)。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41587-025-02887-3
供稿：生命學(xué)院
編輯：李華山
審核：郭玲
