清華新聞網(wǎng)11月28日電 近日，清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心杜亞楠團(tuán)隊(duì)研發(fā)出一種基于液-液相分離（LLPS）的物理開(kāi)關(guān)實(shí)現(xiàn)了人工細(xì)胞（Artificial Cells）的構(gòu)建和環(huán)境響應(yīng)性門(mén)控。該工作不僅展示了一種無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)調(diào)控的全新策略，更為人工細(xì)胞從體外實(shí)驗(yàn)走向體內(nèi)應(yīng)用提供了初步驗(yàn)證。
合成生物學(xué)致力于通過(guò)構(gòu)建人工細(xì)胞來(lái)模擬甚至超越天然細(xì)胞的功能。其中，無(wú)細(xì)胞蛋白合成（CFPS）系統(tǒng)因其開(kāi)放、可編程的特性，成為驅(qū)動(dòng)人工細(xì)胞執(zhí)行任務(wù)的核心引擎。然而，如何將這些在體外試管中表現(xiàn)優(yōu)異的人工細(xì)胞部署到復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境中，并讓其可靠地感知、響應(yīng)并執(zhí)行任務(wù)，是該領(lǐng)域面臨的巨大挑戰(zhàn)。
受天然細(xì)胞內(nèi)一些蛋白（如Tau蛋白）在病理?xiàng)l件下發(fā)生聚集導(dǎo)致功能異常的啟發(fā)，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)并合成了一種功能化仿生聚合物——羧乙基葡聚糖（CE-Dex）。該聚合物攜帶可隨pH變化而改變的電荷，能夠通過(guò)多價(jià)靜電相互作用，可逆地誘導(dǎo)整個(gè)CFPS系統(tǒng)發(fā)生液-液相分離，形成微米級(jí)的聚集體。在聚集體狀態(tài)下，蛋白合成系統(tǒng)被物理性關(guān)閉；而當(dāng)環(huán)境pH升高至堿性時(shí)（如特定病理微環(huán)境），凝聚體能在秒級(jí)時(shí)間內(nèi)迅速解離，從而開(kāi)啟蛋白合成（圖1）。
圖1.CFPS在CE-Dex誘導(dǎo)下通過(guò)分子間作用力形成聚集體，關(guān)閉蛋白合成；在堿性pH作用下重新解離為溶液狀態(tài)開(kāi)啟蛋白合成
為了承載上述聚集和解離的CFPS系統(tǒng)，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)出一套先進(jìn)微流控工程平臺(tái)，用于高通量、穩(wěn)定制備巨型單層囊泡（GUV）作為人工細(xì)胞的載體框架。通過(guò)對(duì)芯片幾何結(jié)構(gòu)和表面親疏水性的精細(xì)調(diào)控，該平臺(tái)在低表面活性劑依賴(lài)的溫和條件下，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)高滲透壓CFPS體系的高效封裝，制造出尺寸高度均一的GUV（圖2）。
圖2.基于微流控的微米囊泡制備系統(tǒng)，用于封裝CFPS體系，并結(jié)合α-溶血素實(shí)現(xiàn)人工細(xì)胞的內(nèi)外通訊
此外，為了讓封裝在內(nèi)部的CFPS系統(tǒng)能與外界環(huán)境進(jìn)行信息和物質(zhì)交換，研究團(tuán)隊(duì)在GUV膜上修飾了α-溶血素（α-HL）納米孔道。該孔道允許離子、氨基酸等小分子自由進(jìn)出，同時(shí)將內(nèi)部蛋白質(zhì)表達(dá)所需要的組件牢牢鎖在人工細(xì)胞內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)了內(nèi)外環(huán)境的受控通訊。
圖3.人工細(xì)胞實(shí)現(xiàn)pH響應(yīng)的CFPS系統(tǒng)相分離聚集和解離
在添加了CE-Dex誘導(dǎo)分子的條件下，人工細(xì)胞內(nèi)部形成了明亮、致密的熒光聚體。當(dāng)人工細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至模擬病理微環(huán)境的堿性pH溶液中，通過(guò)預(yù)置在囊泡膜上的納米孔道，外界的pH信號(hào)被迅速感知。這一關(guān)鍵的體外驗(yàn)證，證實(shí)了LLPS物理開(kāi)關(guān)在微米尺度的受限空間內(nèi)依然能夠高效、可逆地工作。這證明所構(gòu)建的不再僅僅是開(kāi)關(guān)和載體的簡(jiǎn)單組合，而是一個(gè)功能一體化的智能人工細(xì)胞。
最后，研究團(tuán)隊(duì)建立了膽總管結(jié)扎（BDL）小鼠模型，在活體中證實(shí)該模型肝內(nèi)膽管區(qū)域存在一個(gè)穩(wěn)定的局部堿性微環(huán)境（pH ≈ 8.3）?；铙w生物發(fā)光成像結(jié)果清晰地顯示，在小鼠體內(nèi)，人工細(xì)胞成功感知到局部的堿性信號(hào)，其內(nèi)部的聚集體被解離，激活了CFPS進(jìn)行熒光素酶的合成，最終產(chǎn)生了強(qiáng)烈且高度局域化的生物發(fā)光信號(hào)（圖4）。
圖4.人工細(xì)胞于體內(nèi)可控表達(dá)以報(bào)告疾病狀態(tài)
綜上，該人工細(xì)胞能夠作為體內(nèi)微環(huán)境的檢測(cè)和報(bào)告工具，在復(fù)雜的活體環(huán)境中識(shí)別疾病特異性的生化信號(hào)，并將其轉(zhuǎn)化為可被無(wú)創(chuàng)檢測(cè)的可視化信號(hào)。初步的生物安全性評(píng)估顯示，該系統(tǒng)具有良好的體內(nèi)兼容性。
研究提供了一種基于物理相分離的非遺傳性蛋白功能調(diào)控新策略，首次在動(dòng)物模型中驗(yàn)證了人工細(xì)胞作為體內(nèi)診斷報(bào)告工具的可行性。未來(lái)的人工細(xì)胞偵察兵或許能被編程去感知腫瘤微環(huán)境、炎癥區(qū)域等特定酶信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)重大疾病的早期、精準(zhǔn)定位診斷。
研究成果以“基于液-液相分離調(diào)控的無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)構(gòu)建人工細(xì)胞”（Artificial Cells with Liquid-liquid Phase Separation-Regulated Cell-free Protein Synthesis）為題，于11月21日發(fā)表于《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, PNAS）。
清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院教授、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心研究員杜亞楠為論文通訊作者，生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院2020級(jí)博士生樊東東、2023級(jí)博士生梁愷倪為論文共同第一作者。研究得到國(guó)家基金委重點(diǎn)項(xiàng)目等的支持。
論文鏈接：
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2511283122
供稿：生醫(yī)工程學(xué)院
編輯：李華山
審核：郭玲
