醫(yī)學(xué)院布萊恩·科比爾卡教授研究組合作在《科學(xué)》發(fā)文闡述beta2腎上腺素受體胞內(nèi)別構(gòu)激動(dòng)劑的調(diào)控機(jī)理

清華新聞網(wǎng)7月1日電  6月28日，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心布萊恩·科比爾卡（Brian Kobilka）教授研究組合作在《科學(xué)》（Science）期刊在線(xiàn)發(fā)表題為《胞內(nèi)別構(gòu)激動(dòng)劑調(diào)控beta2腎上腺素受體的機(jī)理》（Mechanism of β2AR regulation by an intracellular positive allosteric modulator）的文章，首次報(bào)道了激活態(tài)的beta2腎上腺素受體（β2AR）同時(shí)結(jié)合正構(gòu)激動(dòng)劑BI167107和別構(gòu)激動(dòng)劑Cmpd-6FA的晶體結(jié)構(gòu)。這項(xiàng)工作鑒定了一個(gè)新的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）別構(gòu)調(diào)節(jié)位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)了新的別構(gòu)調(diào)節(jié)機(jī)制，為針對(duì)GPCR的別構(gòu)藥物研發(fā)提供了指導(dǎo)。

G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）家族在人體中有800多個(gè)成員，在視覺(jué)，嗅覺(jué)，味覺(jué)，以及激素和神經(jīng)遞質(zhì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要的生理功能，同時(shí)也是關(guān)鍵的藥物研發(fā)靶點(diǎn)。目前絕大多數(shù)的GPCR藥物靶向其正構(gòu)位點(diǎn)，即天然底物結(jié)合的位點(diǎn)。正構(gòu)位點(diǎn)在不同亞型的GPCR之間保守性較高，以致正構(gòu)藥物常存在亞型選擇性較差的問(wèn)題。別構(gòu)調(diào)節(jié)物指的是不結(jié)合在GPCR正構(gòu)底物結(jié)合位點(diǎn)的小分子化合物。其結(jié)合位置通常保守性較低，因此有可能具有更好的選擇性。近年來(lái)，不少GPCR結(jié)合別構(gòu)調(diào)節(jié)物的結(jié)構(gòu)被報(bào)道出來(lái)，但是這些結(jié)構(gòu)多數(shù)報(bào)道的是別構(gòu)拮抗劑，它們將GPCR穩(wěn)定在非激活狀態(tài)。在本工作發(fā)表之前，僅有一個(gè)激活態(tài)GPCR結(jié)合小分子別構(gòu)激動(dòng)劑的結(jié)構(gòu)被發(fā)表，即布萊恩·科比爾卡在斯坦福大學(xué)研究組于2013年發(fā)表的激活態(tài)M2乙酰膽堿受體結(jié)合別構(gòu)激動(dòng)劑LY2119620的結(jié)構(gòu)(Kruse et al., 2013)。

Beta2腎上腺素受體屬于 GPCR家族，在心肺系統(tǒng)中起重要調(diào)節(jié)作用。Beta2腎上腺素受體的配體，如beta阻滯劑（beta-blocker）和beta激動(dòng)劑（beta-agonist），是常用的治療心血管和呼吸道疾病的臨床藥物。在2017年，布萊恩·科比爾卡教授在清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究組和杜克大學(xué)羅伯特·萊夫科維茨（Robert Lefkowitz）教授研究組合作在《自然》發(fā)文報(bào)道了Beta2腎上腺素受體結(jié)合首個(gè)胞內(nèi)別構(gòu)拮抗劑Cmpd-15的結(jié)構(gòu)(Liu et al., 2017)。近期羅伯特·萊夫科維茨教授研究組通過(guò)DNA編碼的小分子庫(kù)篩選發(fā)現(xiàn)另一個(gè)小分子化合物Cmpd-6對(duì)beta2腎上腺素受體具有別構(gòu)激動(dòng)劑的活性(Ahn et al., 2018)。其能提高beta2腎上腺素受體對(duì)正構(gòu)激動(dòng)劑的親和力，并且能與下游信號(hào)傳導(dǎo)蛋白如G蛋白和arrestin協(xié)同作用，介導(dǎo)下游信號(hào)的傳導(dǎo)。

布萊恩·科比爾卡教授研究組和羅伯特·萊夫科維茨教授研究組合作，嘗試?yán)玫鞍踪|(zhì)晶體學(xué)的手段獲得激活態(tài)β2AR與Cmpd-6的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。然而初期的多次嘗試都無(wú)法檢測(cè)到Cmpd-6的電子密度。研究人員分析認(rèn)為這是由于Cmpd-6溶解度較低，且親和力較弱（uM級(jí)別），導(dǎo)致在晶體里面Cmpd-6的占有率較低，無(wú)法檢測(cè)到電子密度。為了解決這個(gè)問(wèn)題，羅伯特·萊夫科維茨教授研究組在Cmpd-6上引入乙酸基團(tuán)獲得溶解度更高的衍生物Cmpd-6FA。布萊恩·科比爾卡研究組發(fā)現(xiàn)在較高沉淀劑PEG400濃度下Cmpd-6FA溶解度比較高，并經(jīng)過(guò)一系列的晶體篩選和優(yōu)化，成功在高PEG400濃度的條件下獲得了激活態(tài)β2AR的晶體。最終在一個(gè)添加了3 mM Cmpd-6FA的結(jié)晶條件下收到了3.2埃的晶體數(shù)據(jù)，并且觀(guān)測(cè)到了屬于Cmpd-6FA的電子密度。Cmpd-6FA結(jié)合在跨膜螺旋2、3、4和第二胞內(nèi)環(huán)（ICL2）形成的結(jié)合口袋里（圖1）。 

圖1：Cmpd-6FA的分子式及對(duì)β2AR的別構(gòu)激活劑活性，以及激活態(tài)β2AR結(jié)合納米抗體NB6B9，正構(gòu)激動(dòng)劑BI167107和別構(gòu)激動(dòng)劑Cmpd-6FA的結(jié)構(gòu)。

有趣的是，β2AR的第二胞內(nèi)環(huán)在非激活態(tài)下是無(wú)規(guī)卷曲的結(jié)構(gòu)，在激活態(tài)下是alpha螺旋結(jié)構(gòu)。而Cmpd-6FA的結(jié)合穩(wěn)定了其alpha螺旋結(jié)構(gòu)。一方面，這有助于β2AR與下游Gs蛋白的結(jié)合。另一方面，為了形成第二胞內(nèi)環(huán)的螺旋結(jié)構(gòu)，β2AR的跨膜螺旋3（TM3）需要向內(nèi)移動(dòng)大約3埃，螺旋3的內(nèi)移引起跨膜螺旋5和6（TM5和TM6）的外移，而后者是GPCR激活態(tài)的標(biāo)志性構(gòu)象。因此，盡管Cmpd-6FA結(jié)合在胞內(nèi)的位置，它促使β2AR更傾向于處在激活狀態(tài)，進(jìn)而影響結(jié)合在β2AR胞外口袋的正構(gòu)激動(dòng)劑的親和力（圖2）。這一機(jī)理不同于之前報(bào)道的LY2119620影響M2乙酰膽堿受體的機(jī)理。LY2119620結(jié)合在M2乙酰膽堿受體的胞外口袋直接阻止正構(gòu)激動(dòng)劑的解離。 

圖2：別構(gòu)激動(dòng)劑Cmpd-6FA調(diào)節(jié)β2AR的分子機(jī)理。（A） Cmpd-6FA的結(jié)合有助于β2AR與Gs蛋白形成復(fù)合物。（B）Cmpd-6FA的結(jié)合引起TM3的內(nèi)移，進(jìn)而引起TM5和TM6的外移，從而使受體更傾向于處在激活狀態(tài)。

研究人員設(shè)計(jì)了一系列的Cmpd-6的衍生物，并測(cè)試了其活性。其結(jié)果與結(jié)構(gòu)模型相互支持。Cmpd-6對(duì)于β2AR具有亞型選擇性，它能顯著提高β2AR對(duì)于正構(gòu)激動(dòng)劑的親和力，而對(duì)同一家族的β1AR影響很小。分析表明在參與結(jié)合Cmpd-6的14個(gè)氨基酸中，只有7個(gè)在β2AR和β1AR之間是一樣的。當(dāng)把β1AR結(jié)合位點(diǎn)上的氨基酸突變成和β2AR一樣時(shí)，Cmpd-6對(duì)β1AR也有較強(qiáng)的別構(gòu)激動(dòng)劑活性。這一突變實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了結(jié)構(gòu)模型。

Cmpd-6的別構(gòu)位置可能普遍存在于其他GPCR中。該位置和別構(gòu)激動(dòng)劑AP8結(jié)合游離脂肪酸受體GPR40的位置有部分重合(Lu et al., 2017)。另外近期有研究組利用突變實(shí)驗(yàn)鑒定出多巴胺受體D1R的別構(gòu)激動(dòng)劑DETQ可能結(jié)合在其第二胞內(nèi)環(huán)(Wang et al., 2018)。本工作鑒定出來(lái)的Cmpd-6結(jié)合模型可能用于指導(dǎo)其他GPCR的別構(gòu)激動(dòng)劑的設(shè)計(jì)。

本論文是清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心、斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子與細(xì)胞生理學(xué)系布萊恩·科比爾卡教授與杜克大學(xué)羅伯特·萊夫科維茨教授共同合作的成果。布萊恩·科比爾卡教授與羅伯特·萊夫科維茨教授為本文的共同通訊作者。清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉翔宇博士與杜克大學(xué)Ali Masoudi博士和Alem W. Kahsai博士為本文的共同第一作者。本課題得到北京市結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心和生命科學(xué)聯(lián)合中心的資助。衍射數(shù)據(jù)收集得到日本Spring-8同步輻射光源的支持和協(xié)助。

論文鏈接：

https://science.sciencemag.org/content/364/6447/1283

供稿：醫(yī)學(xué)院

編輯：李華山

審核：周襄楠