生命學(xué)院楊茂君教授團(tuán)隊(duì)在《科學(xué)》發(fā)文解析線(xiàn)粒體氧化磷酸化系統(tǒng)研究領(lǐng)域重要研究進(jìn)展
清華新聞網(wǎng)6月14日電 6月14日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院楊茂君教授及其研究團(tuán)隊(duì)在國(guó)際著名期刊《科學(xué)》（Science）上發(fā)表了題為《結(jié)合IF1抑制蛋白的哺乳動(dòng)物ATP合酶四聚體冷凍電鏡結(jié)構(gòu)》（Cryo-EM structure of the mammalian ATP synthase tetramer bound with inhibitory protein IF1）的研究長(zhǎng)文。研究通過(guò)高性能冷凍電鏡技術(shù)，解析了分子量高達(dá)280萬(wàn)道爾頓的哺乳動(dòng)物ATP合酶四聚體6.2埃的結(jié)構(gòu)，以及完整的（19種亞基）、兩種狀態(tài)的ATP合酶單體3.34埃和3.45埃結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖）。通過(guò)對(duì)結(jié)構(gòu)的分析，闡釋了高等哺乳動(dòng)物ATP合酶的結(jié)構(gòu)組成樣式、發(fā)揮功能的分子機(jī)理、復(fù)合物之間協(xié)同關(guān)系以及對(duì)線(xiàn)粒體嵴的形態(tài)的影響，為治療能量代謝疾病、神經(jīng)退行疾病等，提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
經(jīng)過(guò)多年的努力，楊茂君教授研究團(tuán)隊(duì)于2016年終于攻克了哺乳動(dòng)物線(xiàn)粒體呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物的原子分辨率結(jié)構(gòu)這一難題。2017年，研究團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)大量探索，首次從體外培養(yǎng)的人源細(xì)胞中分離、純化出高純度的呼吸鏈蛋白復(fù)合物，并且首次發(fā)現(xiàn)并解析了人源超超級(jí)復(fù)合物I2III2IV2中高分辨率三維結(jié)構(gòu)。人源線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物純化方法的建立及其結(jié)構(gòu)的解析，為今后的藥物研發(fā)打下了良好的基礎(chǔ)。此外，楊教授研究團(tuán)隊(duì)還在高等動(dòng)物呼吸鏈復(fù)合物III非對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)、人源呼吸鏈復(fù)合物IV 14亞基完整結(jié)構(gòu)等方面取得重要的進(jìn)展。
哺乳動(dòng)物ATP合酶四聚體整體結(jié)構(gòu)
在此次發(fā)表的論文中，楊茂君教授研究團(tuán)隊(duì)首次分離、純化出哺乳動(dòng)物ATP合酶四聚體蛋白。由于該四聚體蛋白由多達(dá)120個(gè)亞基組成，各個(gè)亞基排布松散，非常不穩(wěn)定，如果增加純化步驟提高純度會(huì)一定程度破壞其完整性；相反，粗提取的蛋白不能滿(mǎn)足冷凍電鏡樣品的要求，目的顆粒所占比例過(guò)低，無(wú)法收集到足夠多的蛋白顆粒用于計(jì)算。面對(duì)這樣的難題，楊茂君教授研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)反復(fù)實(shí)踐，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，在兩者之間選取了很好的平衡點(diǎn)，既保證了該超大復(fù)合物蛋白的完整性，同時(shí)又滿(mǎn)足了冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集的要求。
然而，由于該結(jié)構(gòu)過(guò)于巨大，且存在多種構(gòu)象，在嘗試了幾乎所有能夠利用的計(jì)算程序和方法之后，依然無(wú)法得到該超大蛋白質(zhì)機(jī)器的高分辨率結(jié)構(gòu)。在對(duì)初步計(jì)算結(jié)果深度分析之后，楊茂君敏銳的發(fā)現(xiàn)，在該H型的ATP合酶四聚體蛋白中，對(duì)角的兩個(gè)ATP合酶復(fù)合物單體具有相似的構(gòu)象。他進(jìn)而采用了一種新的計(jì)算方法，將四聚體中四個(gè)ATP合酶拆分后重新居中，然后單獨(dú)挖出顆粒，進(jìn)而將對(duì)角構(gòu)象相似的顆粒合并。這樣做不僅極大地縮小了計(jì)算中的分子尺度，而且還能提高顆粒數(shù)量。在后續(xù)的計(jì)算中逐步將這兩類(lèi)不同構(gòu)象的ATP合酶復(fù)合物單體的分辨率提高到了原子分辨率水平。
對(duì)于這種新穎的純化及計(jì)算方法，審稿專(zhuān)家給予了高度的評(píng)價(jià)：“他們將溫和、部分提取純化的方法與大數(shù)據(jù)收集相結(jié)合，該方法將為不能采用常規(guī)純化手段獲得的、高度脆弱的蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究開(kāi)辟新的途徑。”（Their approach of mild, partial purification combined with the collection of a large image data set will open new avenues in the structural biology of highly fragile complexes that are not amenable to standard purification procedures.）
文章重點(diǎn)報(bào)道了目前發(fā)現(xiàn)的最完整的哺乳動(dòng)物ATP合酶單體結(jié)構(gòu)，以及各個(gè)亞基在復(fù)合物中的位置和功能。ATP合酶單體是由19種不同的亞基，共有30個(gè)蛋白來(lái)構(gòu)成的超大復(fù)合物。新鑒定的亞基多包裹于A(yíng)TP合酶四聚體中間區(qū)域，意味著只有在四聚體蛋白中才能包含全部亞基。兩種不同構(gòu)象的ATP合酶單體結(jié)構(gòu)完美的解釋和驗(yàn)證了哺乳動(dòng)物ATP合酶合成ATP的分子機(jī)制。
ATP合酶四聚體由120個(gè)蛋白亞基構(gòu)成，是由兩個(gè)相似的構(gòu)象的ATP合酶二聚體通過(guò)反向平行組合在一起形成一個(gè)四聚體，四聚體在跨膜區(qū)形成一個(gè)高曲率的曲面，可以很好的解釋它們?cè)诰€(xiàn)粒體嵴上的排布方式。本次解析的ATP合酶四聚體處于活性抑制狀態(tài)。線(xiàn)粒體內(nèi)膜上存在大量的蛋白質(zhì)，其中蛋白與磷脂的比例大約是7:3，ATP合酶分子大約占到所有蛋白的20%左右。大多數(shù)ATP合酶平常都會(huì)處于抑制狀態(tài)，只有在細(xì)胞需要大量能量的時(shí)候才會(huì)被激活合成ATP分子。
本次研究發(fā)現(xiàn)ATP合酶四聚體在多個(gè)位點(diǎn)上實(shí)行協(xié)同抑制-激活機(jī)制。當(dāng)線(xiàn)粒體基質(zhì)質(zhì)子濃度升高，內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子濃度差降低時(shí)，IF1蛋白亞基會(huì)通過(guò)其C端形成二聚體，其N(xiāo)端深深的插入到ATP合酶行使催化功能的F1部分，阻止ATP合酶催化亞基構(gòu)象變化，使其不能合成ATP分子。二聚的IF1將ATP合酶四聚體中F1部分兩兩固定的在一起。當(dāng)線(xiàn)粒體基質(zhì)質(zhì)子濃度降低時(shí)，質(zhì)子濃度差升高時(shí)，IF1蛋白會(huì)形成四聚體，將其N(xiāo)端從ATP合酶的F1部分抽離出來(lái)，解除這種抑制。與此同時(shí)，質(zhì)子濃度差降低時(shí)，在A(yíng)TP合酶的膜間隙一側(cè)，e亞基的C端會(huì)與位于c8-ring中間的6.8PL亞基的C端結(jié)合，進(jìn)而抑制c8-ring的轉(zhuǎn)動(dòng)。反之，抑制解除?？偠灾?，ATP合酶可以感知線(xiàn)粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子梯度的變化，進(jìn)而調(diào)整其活性。
在文章的審稿過(guò)程中，審稿人對(duì)于該研究給予了很高的評(píng)價(jià)：“IF1抑制的四聚體結(jié)構(gòu)是‘第一個(gè)’F型ATP酶的四聚體結(jié)構(gòu)，也是哺乳動(dòng)物ATP合酶第一個(gè)真正意義上的完整結(jié)構(gòu)，幾十年來(lái)，世界范圍內(nèi)眾多結(jié)構(gòu)生物學(xué)家為之進(jìn)行了大量的努力，都沒(méi)能完成楊教授團(tuán)隊(duì)這樣的成績(jī)。”（The IF1-inhibited tetramer structure is a “first” for any F-ATP synthase and also the first truly intact structure of a mammalian enzyme, a feat that has eluded structural biologists for decades despite intense efforts in many labs across the world.）
楊茂君教授研究團(tuán)隊(duì)將再接再厲對(duì)線(xiàn)粒體氧化磷酸化系統(tǒng)進(jìn)行更加深入的研究，并將致力于研發(fā)治療線(xiàn)粒體異常疾病的新型靶向藥物。
清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院谷金科（博士后）、張來(lái)幸（2015級(jí)博士生）、宗帥（結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心卓越學(xué)者）、郭潤(rùn)域（結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心卓越學(xué)者、水木學(xué)者）是此篇論文的共同第一作者，楊茂君教授為本文的通訊作者。劉天涯（2016級(jí)博士生）、易靜波（2018級(jí)博士生）、卓微（博士后）也參與了相關(guān)研究工作。南方科技大學(xué)冷凍電鏡中心主任王培毅教授也為本研究提供了大力支持。本項(xiàng)工作受到了科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金委、清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖中心、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心及清華大學(xué)自主科研計(jì)劃的大力支持。
論文鏈接：
https://science.sciencemag.org/content/364/6445/1068
供稿：生命學(xué)院
編輯：李華山
審核：周襄楠
