醫(yī)學(xué)院布萊恩·科比爾卡研究組揭示G蛋白偶聯(lián)受體-G蛋白復(fù)合物形成過(guò)程
清華新聞網(wǎng)5月15日電 5月9日，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心布萊恩·科比爾卡（Brian K. Kobilka）教授研究組于《細(xì)胞》 （Cell） 雜志在線(xiàn)發(fā)表了題為《G蛋白偶聯(lián)受體- G蛋白復(fù)合物形成過(guò)程的結(jié)構(gòu)機(jī)理》（Structural Insights into the Process of GPCR-G Protein Complex Formation）的研究論文。論文報(bào)道了 beta2 腎上腺素受體（β2AR）融合Gs蛋白羧基端肽段（GsCT）的晶體結(jié)構(gòu)以及GDP結(jié)合狀態(tài)下Gs蛋白（GsGDP）的晶體結(jié)構(gòu)，并基于結(jié)構(gòu)首次提出了beta2 腎上腺素受體-Gs蛋白復(fù)合物在形成過(guò)程的初始階段可能的分子模型?！都?xì)胞》期刊同期還以背靠背的方式發(fā)表了布萊恩·科比爾卡教授在斯坦福大學(xué)研究組的題為《G蛋白偶聯(lián)受體-G蛋白復(fù)合物的組裝》(Assembly of a GPCR-G protein Complex)的研究論文，報(bào)道了利用氫氘交換質(zhì)譜分析和X射線(xiàn)輻射裂解蛋白印記質(zhì)譜分析研究 beta2 腎上腺素受體與Gs蛋白復(fù)合物形成的動(dòng)態(tài)過(guò)程的工作。兩篇論文相互印證，共同揭示了G蛋白偶聯(lián)受體與 G蛋白復(fù)合物形成的分子機(jī)理。
G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）家族在人體中有800多個(gè)成員，在視覺(jué)，嗅覺(jué)，味覺(jué)，以及激素和神經(jīng)遞質(zhì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要的生理功能，同時(shí)也是關(guān)鍵的藥物研發(fā)靶點(diǎn)。GPCR作為膜受體蛋白，對(duì)外感知胞外的配體信號(hào)，對(duì)內(nèi)結(jié)合G蛋白或者Arrestin，將信號(hào)向下游傳遞，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。在激動(dòng)劑的作用下，GPCR會(huì)與二磷酸鳥(niǎo)苷（GDP）結(jié)合狀態(tài)的G蛋白，形成短暫的復(fù)合物（GPCR-GGDP），誘發(fā)GDP的釋放，得到無(wú)核酸結(jié)合的GPCR-G蛋白復(fù)合物（GPCR-Gempty）。三磷酸鳥(niǎo)苷（GTP）隨后與GPCR-Gempty狀態(tài)下的G蛋白結(jié)合，引起 G蛋白解離成Gα 與 Gβγ亞基，進(jìn)而激活下游的靶蛋白，傳遞細(xì)胞信號(hào)（圖1）。
圖1 GPCR與G蛋白復(fù)合物形成過(guò)程示意圖
布萊恩·科比爾卡教授在斯坦福大學(xué)的課題組在GPCR結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域做出了開(kāi)創(chuàng)性的工作。其于2007年首次獲得了beta2腎上腺素受體的非激活態(tài)高分辨率結(jié)構(gòu)，并于2011年利用模擬G蛋白的納米抗體穩(wěn)定beta2腎上腺素受體的激活態(tài)構(gòu)象，獲得了其激活態(tài)結(jié)構(gòu)。更于2011年發(fā)表了beta2腎上腺素受體與Gs蛋白在無(wú)核酸狀態(tài)下（β2AR-Gsempty）的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，首次在原子水平觀(guān)測(cè)到信號(hào)從配體傳遞到受體再到G蛋白，該研究是GPCR領(lǐng)域里程碑式的成果。值得注意的是，在獲得β2AR-Gsempty結(jié)構(gòu)的研究中，研究者們使用核苷酸酶Apyrase水解去除復(fù)合物中的GDP，從而獲得更加穩(wěn)定的無(wú)核苷酸結(jié)合的GPCR-G蛋白復(fù)合物（GPCR-Gempty） 。使用Apyrase水解GDP以獲得穩(wěn)定GPCR-G蛋白復(fù)合物的方法，也成為了獲得GPCR-G蛋白復(fù)合物的通用方法。隨著冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展，目前在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)里面有超過(guò)10個(gè)不同GPCR-G蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，所有的復(fù)合物都被穩(wěn)定在沒(méi)有核苷酸結(jié)合的GPCR-Gempty狀態(tài)。然而這些復(fù)合物結(jié)構(gòu)并沒(méi)有很好的解釋 GPCR與G蛋白結(jié)合的特異性。多項(xiàng)研究表明，GPCR與GDP結(jié)合的G蛋白之間存在一個(gè)中間狀態(tài)的復(fù)合物。這個(gè)中間態(tài)的復(fù)合物可能代表了GPCR與G蛋白特異性識(shí)別的初始狀態(tài)。但由于該復(fù)合物是一個(gè)不穩(wěn)定的中間態(tài)，其結(jié)構(gòu)信息很難獲得。
相比于非激活態(tài)的GPCR，激活態(tài)的GPCR結(jié)構(gòu)上最顯著的特點(diǎn)在于第六個(gè)跨膜螺旋的外移（ 10埃甚至更遠(yuǎn)的距離）。布萊恩·科比爾卡教授研究組利用多種技術(shù)證明：在只有激動(dòng)劑結(jié)合的情況下，beta2 腎上腺素受體無(wú)法穩(wěn)定在激活構(gòu)象，需要同時(shí)在胞內(nèi)區(qū)域有其他蛋白（納米抗體或者G蛋白）穩(wěn)定其激活態(tài)結(jié)構(gòu)。布萊恩·科比爾卡教授多年以前啟動(dòng)一個(gè)課題，試圖將Gs蛋白羧基端的肽段融合在beta2 腎上腺素受體的羧基端，以獲得其穩(wěn)定在激活態(tài)的結(jié)構(gòu)，但是該課題沒(méi)有成功。其在清華大學(xué)的研究組改進(jìn)了蛋白編輯策略，將Gs蛋白羧基端的14個(gè)氨基酸（GsCT）融合在beta2 腎上腺素受體的胞內(nèi)第三個(gè)環(huán)狀區(qū)域，并引入二硫鍵將GsCT穩(wěn)定在其結(jié)合位置，最終獲得了3.7埃的 beta2 腎上腺素受體激活態(tài)下的晶體結(jié)構(gòu)。在該結(jié)構(gòu)中觀(guān)察到的 Gs蛋白羧基端與受體相互作用的方式不同于2011年解析的β2AR-Gsempty復(fù)合物（PDB：3SN6）。Gs蛋白羧基端的兩個(gè)帶電的氨基酸E392Gs和R389Gs與受體相互作用，而在之前的β2AR-Gsempty復(fù)合物中與受體結(jié)合的兩個(gè)氨基酸Y391Gs和H387Gs卻指向了相反的方向（圖2）。分子動(dòng)力學(xué)模擬表明這種結(jié)合方式幾乎與β2AR-Gsempty 的復(fù)合物中觀(guān)察到的結(jié)合方式一樣穩(wěn)定。
圖2 beta2 腎上腺素受體與Gs蛋白C末端的14個(gè)氨基酸（GsCT）融合蛋白的晶體結(jié)構(gòu)（A），在該結(jié)構(gòu)中，帶電荷的氨基酸E392Gs和R389Gs與β2AR相互作用，而Y391Gs和H387Gs不參與β2AR的相互作用（B）。這一相互作用模式與β2AR-Gsempty（PDB： 3SN6）結(jié)構(gòu)里觀(guān)察到的方式相反（C）
同時(shí)，研究組獲得了2.8埃的GDP結(jié)合狀態(tài)下Gs蛋白（GsGDP）的晶體結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中，Gs蛋白羧基端的Y391Gs和H387Gs與Gs蛋白內(nèi)部其它氨基酸形成了相互作用，而E392Gs和R389Gs則暴露在Gs蛋白的表面。因此推測(cè)E392Gs和R389Gs 更有可能參與GPCR受體與G蛋白之間的初始相互作用。隨后研究組通過(guò)多種生物化學(xué)手段和分子動(dòng)力學(xué)模擬驗(yàn)證了E392Gs和R389Gs 在受體與G蛋白形成復(fù)合物過(guò)程中的重要作用。最后研究組搭建了beta2 腎上腺素受體與GDP結(jié)合狀態(tài)下Gs蛋白的復(fù)合物（β2AR-GsGDP）的模型，并提出了從 GsGDP，到β2AR-GsGDP，最后到β2AR-Gsempty的復(fù)合物形成的動(dòng)態(tài)模型（圖3）。
圖3 β2AR與Gs蛋白形成復(fù)合物的動(dòng)態(tài)模型。在GsGDP狀態(tài)E392Gs和R389Gs暴露在Gs蛋白表面（A）。Gs蛋白羧基端肽段經(jīng)過(guò)小的構(gòu)象變化（B）可以與β2AR形成中間態(tài)復(fù)合物β2AR-GsGDP（C），在該復(fù)合物狀態(tài)下，Gs蛋白利用帶電氨基酸E392Gs和R389Gs與β2AR相互作用。隨著GDP的釋放， β2AR-GsGDP 復(fù)合物經(jīng)過(guò)構(gòu)象變化，成為無(wú)核酸結(jié)合的β2AR-Gsempty復(fù)合物（D），在β2AR-Gsempty復(fù)合物中，Gs利用Y391Gs和H387Gs和β2AR相互作用
清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院布萊恩·科比爾卡教授與劉翔宇博士為本文的共同通訊作者。清華大學(xué)劉翔宇博士， 博士生許心宇，以及斯坦福大學(xué)Daniel Hilger博士為本文共同第一作者。清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉洪濤博士、孫曉鷗博士、斯坦福大學(xué)杜洋博士（即將成為香港中文大學(xué)（深圳）科比爾卡新藥研究院Tenure-track助理教授）參與了本項(xiàng)研究。本課題得到清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心，北京市高精尖結(jié)構(gòu)生物學(xué)中心的資助。
原文鏈接：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)30440-4
供稿：醫(yī)學(xué)院
編輯：李華山
審核：周襄楠
