藥學(xué)院饒燏課題組成功利用PROTAC技術(shù)降解多種突變型BTK蛋白

克服對(duì)臨床一線(xiàn)藥物依魯替尼耐藥的非霍奇金淋巴瘤

清華新聞網(wǎng)3月27日電 抗癌藥物耐藥無(wú)疑是相關(guān)患者最痛苦的事。全球銷(xiāo)售額排名前20的依魯替尼是近年來(lái)治療淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞性白血病的明星分子，即使是這樣療效顯著的靶向藥也難以避免耐藥的發(fā)生。3月19日，清華大學(xué)藥學(xué)院饒燏課題組與生科院劉萬(wàn)里課題組，以及北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院朱軍課題組合作在血液學(xué)國(guó)際著名期刊《白血病》（Leukemia）在線(xiàn)發(fā)表了最新研究成果《利用PROTAC技術(shù)降解多種突變型BTK蛋白克服依魯替尼耐藥的非霍奇金淋巴瘤的潛在治療方案》（Degradation of Bruton’s tyrosine kinase mutants by PROTACs for potential treatment of Ibrutinib -resistant Non-Hodgkin lymphomas）。該論文通過(guò)構(gòu)建新型高溶解度的BTK蛋白高效降解劑，成功高效的降解多種臨床相關(guān)的突變型BTK蛋白，克服了臨床上非霍奇金淋巴瘤由于BTK蛋白突變引起的對(duì)臨床一線(xiàn)藥物依魯替尼的耐藥性。更為重要的是，新策略克服腫瘤耐藥的有效性得到了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

布魯頓酪氨酸蛋白激酶（Bruton's tyrosine kinase，BTK）屬于非受體型酪氨酸蛋白激酶，在B淋巴細(xì)胞信號(hào)通路（BCR）上游部分發(fā)揮著重要作用。作為T(mén)ec激酶家族的一員，BTK在B淋巴細(xì)胞分化和發(fā)育中起到關(guān)鍵作用。除了T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，BTK只在造血細(xì)胞中有表達(dá)。在生物體中，BTK蛋白發(fā)揮了非常重要的生理功能。1952年美國(guó)兒科專(zhuān)家Ogdon Bruton發(fā)現(xiàn)如果在兒童體內(nèi)缺乏某種抗體，就會(huì)導(dǎo)致X-相關(guān)血中丙球蛋白貧乏癥（XLA），導(dǎo)致復(fù)發(fā)性的細(xì)菌感染和敗血癥。1993年，導(dǎo)致X-相關(guān)血中丙球蛋白貧乏癥的基因被最終確認(rèn)，在人體中，如果基因組中缺乏BTK基因，會(huì)導(dǎo)致B細(xì)胞數(shù)明顯下降，并且伴有血清丙種蛋白水平下降。

在活化的外周血B細(xì)胞樣（activated B-cell-like，ABC樣）彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）中，BTK在這類(lèi)細(xì)胞的免疫逃逸中發(fā)揮著重要作用。BTK蛋白是首例在發(fā)現(xiàn)的在細(xì)胞凋亡方面具有雙功能條件作用的TEC家族激酶，在B淋巴細(xì)胞中能夠促進(jìn)自由基引發(fā)的細(xì)胞凋亡，但是卻能夠抑制Fas活化的細(xì)胞凋亡。在BCR的通路上，BTK蛋白是受酪氨酸蛋白激酶LYN和脾酪氨酸激酶SYK激活的，當(dāng)BTK蛋白活化后，即可激活下游蛋白PLC-γ2，然后促進(jìn)內(nèi)源性鈣離子、甘油二酯（DAG）、三磷酸肌醇（IP3）的釋放，最終激活細(xì)胞核因子（NF-κB）的活化，從而抑制B淋巴細(xì)胞的凋亡，并且促進(jìn)癌癥的發(fā)生。

非霍奇金淋巴瘤（NHL）是B細(xì)胞惡性腫瘤的一種，僅美國(guó)每年新增病例6萬(wàn)余人。彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）是NHL中最常見(jiàn)的一種，在美國(guó)和英國(guó)每年的發(fā)病率高達(dá)0.08%。套細(xì)胞淋巴瘤（MCL）作為NHL的一種，5年生存率小于50%。BTK共價(jià)抑制劑依魯替尼一直是治療多種非霍奇金淋巴瘤的一線(xiàn)用藥，包括套細(xì)胞淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病、華氏巨球蛋白血癥。2018年，依魯替尼的全球銷(xiāo)售額是44.5億美元，比2017年增長(zhǎng)39.4%。盡管如此，根據(jù)最新的臨床數(shù)據(jù)報(bào)道，針對(duì)依魯替尼已經(jīng)出現(xiàn)了嚴(yán)重的耐藥性。由于BTK蛋白481位半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸（C481S），使得依魯替尼的活性下降近500倍，臨床數(shù)據(jù)已經(jīng)證明這一突變是病人產(chǎn)生對(duì)依魯替尼耐藥的根本原因。并且證明，BTK蛋白481位其他突變也會(huì)引起依魯替尼失效。 

圖1：降解依魯替尼耐藥的C481突變BTK示意圖。A L18I降解C481突變BTK的機(jī)制；B 野生型及表達(dá)C481T (C/S)突變型BTK蛋白的Hela細(xì)胞，L18I處理4天后BTK蛋白量隨藥物濃度的變化曲線(xiàn)；C 表達(dá)C481G (W/A)突變型BTK蛋白的Hela細(xì)胞，L18I處理4天后BTK蛋白量隨藥物濃度的變化曲線(xiàn)；D BTK降解劑的設(shè)計(jì)示意圖E BTK C481S 突變的HBL-1細(xì)胞系，L18I處理36h后細(xì)胞中pPLCγ-2, PLCγ-2, p-ERK1/2, ERK1/2, p-p38, p38, 以及β-actin蛋白含量隨藥物濃度的變化曲線(xiàn)。

饒燏課題組通過(guò)構(gòu)建全新骨架的PROTAC小分子，招募E3泛素化連接酶靶向降解BTK蛋白。新構(gòu)建的BTK蛋白降解劑可以在轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中以小于50 nM的藥物濃度高效降解多種突變類(lèi)型（C481S/T/A/G/W）的BTK蛋白。更為重要的是，新策略可以引起突變型DLBCL腫瘤內(nèi)BTK蛋白水平的降低，從而在體內(nèi)有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)，克服腫瘤BTK激酶由于C481位點(diǎn)突變引起的對(duì)臨床一線(xiàn)藥物依魯替尼的耐藥性。除此之外，本研究還針對(duì)BTK蛋白下游信號(hào)進(jìn)行了探索，如PLC-γ2、p38及ERK1/2，明確了新型PROTAC分子作用于BTK蛋白后引起的細(xì)胞下游信號(hào)的改變，從機(jī)制層面上闡述了新策略發(fā)揮抗腫瘤效果的原因。

除治療DLBCL外，新型PROTAC小分子也可以有效抑制MCL（mino及Z138），其效果優(yōu)于目前臨床一線(xiàn)藥物依魯替尼。本研究的另一大亮點(diǎn)是將PROTAC策略與傳統(tǒng)小分子抑制劑聯(lián)用，如copanlisib、dasatinib等，大大提高了PROTAC策略的抗腫瘤效果。 

圖2：L18I藥效學(xué)研究；A  L18I和依魯替尼對(duì)BTK C481S突變型HBL-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制活性；B L18I和依魯替尼對(duì)BTK C481S突變過(guò)表達(dá)型MCL (Mino or Z138)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制活性；C 與依魯替尼相比，L18I在BTK C481S突變的小鼠腫瘤（HBL-1）模型中顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)并對(duì)小鼠體重?zé)o明顯影響；D L18I處理后，小鼠腫瘤組織 C481S突變的BTK蛋白水平。

該工作為基于PROTAC進(jìn)行抗耐藥非霍奇金淋巴瘤的藥物研發(fā)提供了重要信息，目前該團(tuán)隊(duì)研究人員在進(jìn)一步進(jìn)行此類(lèi)新型化合物的開(kāi)發(fā)工作，希望繼續(xù)提高其代謝穩(wěn)定性及抗腫瘤效果。

饒燏課題組致力于探究細(xì)胞內(nèi)靶向蛋白質(zhì)降解技術(shù)（proteolysis-targeting chimeras，PROTAC），以及將PROTAC技術(shù)轉(zhuǎn)化為臨床相關(guān)的抗腫瘤活性分子，并于近年來(lái)陸續(xù)在《細(xì)胞研究》《化學(xué)通訊》《蛋白質(zhì)和細(xì)胞》《細(xì)胞發(fā)現(xiàn)》《白血病》等重要期刊中。

 清華大學(xué)饒燏教授、劉萬(wàn)里教授和北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院朱軍教授為本論文共同通訊作者。饒燏課題組博士生孫永匯、北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院副研究員丁寧以及北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院研究員宋玉琴為本文并列第一作者。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金以及國(guó)家重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目的資助，同時(shí)也得到了北京自然科學(xué)基金的大力支持。

原文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41375-019-0440-x

供稿：藥學(xué)院

編輯：李華山

審核：周襄楠