清華化工系生物育種技術(shù)與裝備團(tuán)隊(duì)在《自然·通訊》發(fā)表文章
利用CRISPR敲低技術(shù)一次性研究數(shù)千個(gè)細(xì)菌基因的功能
清華新聞網(wǎng)6月27日電 6月26日，清華大學(xué)化工系生物育種技術(shù)與裝備團(tuán)隊(duì)在《自然·通訊》（Nature Communications）發(fā)表文章，報(bào)道了一種基于CRISPR/dCas9敲低技術(shù)(CRISPRi)的新型細(xì)菌功能基因組學(xué)方法，可以一次性研究細(xì)菌中數(shù)千個(gè)基因和特定表型的關(guān)系。
經(jīng)過(guò)工程化改造的細(xì)菌免疫CRISPR系統(tǒng)（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）已經(jīng)發(fā)展成為具有廣泛應(yīng)用的基因組編輯工具。近年來(lái)，科學(xué)家逐漸展示了其在高通量基因功能篩選方面的應(yīng)用潛力：首先對(duì)待篩編碼基因進(jìn)行敲除或敲低，并以細(xì)胞生長(zhǎng)或特定標(biāo)記作為一個(gè)表型指標(biāo)，將靶定待研究表型相關(guān)基因的單導(dǎo)向RNA(sgRNA)文庫(kù)富集出來(lái)，并利用高通量測(cè)序技術(shù)定量每個(gè)基因的功能。目前這一策略主要被用來(lái)進(jìn)行高等真核生物的高通量功能基因組學(xué)研究。由于細(xì)菌和高等真核生物基因組的系統(tǒng)性結(jié)構(gòu)差異，在細(xì)菌中使用這種方法的高通量功能篩選尚未見(jiàn)報(bào)道。在這項(xiàng)最新研究工作中，清華大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了大腸桿菌全基因組范圍的sgRNA文庫(kù)，結(jié)合CRISPRi基因敲低技術(shù)，對(duì)于這一模式微生物的一系列重要基因組學(xué)問(wèn)題開(kāi)展了大規(guī)模研究。
利用合成sgRNA文庫(kù)和CRISPRi基因敲低技術(shù)進(jìn)行高通量細(xì)菌功能基因組學(xué)研究
研究團(tuán)隊(duì)首先證明了這一方法可以有效地鑒定出大腸桿菌的已知必需基因，同時(shí)也對(duì)必需基因篩選結(jié)果中和已知數(shù)據(jù)庫(kù)不吻合的部分基因進(jìn)行了進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，更新了對(duì)于該模式微生物必需基因的認(rèn)識(shí)。此外，他們還發(fā)現(xiàn)該方法可以有效地研究細(xì)菌中RNA編碼基因的功能。盡管這類(lèi)基因近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)廣泛的參與細(xì)菌的重要生物學(xué)過(guò)程，但是由于傳統(tǒng)細(xì)菌高通量遺傳分析方法本身的局限，這類(lèi)基因受到了普遍的忽視。有趣的是，利用該方法繪制的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）必需性圖譜，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌中有六個(gè)非必需的tRNA編碼基因，且不同于tRNA普遍的多拷貝特性，這六個(gè)tRNA編碼基因都以單拷貝形式存在于大腸桿菌基因組中。
新型CRISPRi混合篩選鑒定細(xì)菌RNA編碼基因功能
利用隨機(jī)轉(zhuǎn)座子插入文庫(kù)的混合篩查（Tn-seq）是目前應(yīng)用最為廣泛的高通量細(xì)菌系統(tǒng)遺傳分析手段。研究團(tuán)隊(duì)以已知必需基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)，系統(tǒng)分析了新建立的CRISPRi敲低篩選方法相比于轉(zhuǎn)座子測(cè)序的性能優(yōu)劣。結(jié)果表明，在類(lèi)似文庫(kù)規(guī)模條件下，CRISPRi敲低篩選方法相比于隨機(jī)轉(zhuǎn)座子插入文庫(kù)的混合篩查方法，能夠以更低的假陽(yáng)性率捕獲更多的已知必需基因，且編碼區(qū)域長(zhǎng)度越短這一優(yōu)勢(shì)越為明顯。
研究團(tuán)隊(duì)還以氨基酸代謝為例，通過(guò)同工酶功能、色氨酸途徑環(huán)境響應(yīng)等案例展示了本研究建立的CRISPRi方法定量解析微生物代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的能力。同時(shí)，通過(guò)對(duì)于大腸桿菌全基因組范圍內(nèi)對(duì)于糠醛和異丁醇耐受性圖譜的定量分析，發(fā)現(xiàn)了諸多已知和未知的耐受性基因位點(diǎn)，為菌株的工程化改造提供了基礎(chǔ)。
該工作第一次報(bào)道了利用CRISPRi方法結(jié)合高通量混合篩選和測(cè)序?qū)τ诩?xì)菌的功能基因組學(xué)進(jìn)行研究，并通過(guò)對(duì)于結(jié)果的系統(tǒng)分析提出了適用于細(xì)菌基因組結(jié)構(gòu)的sgRNA文庫(kù)設(shè)計(jì)原則。值得一提的是，為了方便廣大研究者使用這一方法，研究團(tuán)隊(duì)還開(kāi)發(fā)了軟件工具，可以一站式的進(jìn)行sgRNA文庫(kù)的設(shè)計(jì)和篩選后的測(cè)序數(shù)據(jù)分析。
化工系張翀副教授為本文通訊作者，生物育種技術(shù)與裝備團(tuán)隊(duì)首席邢新會(huì)教授，信息國(guó)家研究中心、自動(dòng)化系謝震研究員為本文共同作者，他們同時(shí)為清華大學(xué)合成與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心核心成員。清華大學(xué)化工系博士生王天民、關(guān)長(zhǎng)閣為本文的共同第一作者。北京合生基因科技有限公司劉兵亦對(duì)此文給予了一定的幫助。該成果得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委重點(diǎn)儀器研發(fā)項(xiàng)目、面上項(xiàng)目，國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃以及清華大學(xué)自主科研計(jì)劃的資助。
論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-018-04899-x
供稿：化工系 編輯：徐靜 審核：襄楠
