清華醫(yī)學(xué)院布萊恩·克比爾卡研究組揭示beta2腎上腺素受體胞內(nèi)別構(gòu)拮抗劑的工作機(jī)理
清華新聞網(wǎng)8月18日電 8月17日，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心教授布萊恩·克比爾卡 （Brian Kobilka）研究組在《自然》（Nature）期刊在線(xiàn)發(fā)表題為《利用X射線(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)揭示beta2腎上腺素受體胞內(nèi)別構(gòu)拮抗劑的工作機(jī)理》的文章 （Mechanism of intracellular allosteric β2AR antagonist reveled by X-ray crystal structure），首次報(bào)道了beta2腎上腺素受體同時(shí)結(jié)合正構(gòu)拮抗劑卡拉洛爾（carazolol）與胞內(nèi)別構(gòu)拮抗劑Cmpd-15的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，該成果對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體別構(gòu)調(diào)節(jié)物的研發(fā)具有指導(dǎo)意義。
beta2腎上腺素受體和Cmpd-15PA（即修飾后的cmpd-15）復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)。其中a是Cmpd-15PA的化學(xué)結(jié)構(gòu)，b是Cmpd-15PA活性數(shù)據(jù)，c是Cmpd-15PA的電子密度（晶體學(xué)數(shù)據(jù)），d-f展示了復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)，清楚表明Cmpd-15結(jié)合在beta2腎上腺素受體的胞內(nèi)部分。
G蛋白偶聯(lián)受體是一類(lèi)具有七次跨膜結(jié)構(gòu)的膜蛋白受體。這類(lèi)受體可以感知包括氣味分子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、趨化因子等信號(hào)，從而調(diào)節(jié)生理反應(yīng)。G蛋白偶聯(lián)受體是一類(lèi)重要的藥物靶標(biāo)，大約30%的商業(yè)化藥物以G蛋白偶聯(lián)受體作為靶點(diǎn)。由于對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)和功能研究的杰出貢獻(xiàn)，布萊恩·克比爾卡教授和羅伯特·萊夫科維茨教授分享了2012年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。
傳統(tǒng)上針對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體的藥物研發(fā)工作主要以其正構(gòu)底物結(jié)合位點(diǎn)（即天然底物結(jié)合位點(diǎn)）為靶點(diǎn)。這類(lèi)正構(gòu)底物結(jié)合位點(diǎn)在不同亞型的G蛋白偶聯(lián)受體之間往往非常保守。例如，在人體中一共有九個(gè)腎上腺素受體，它們都可以被腎上腺素激活，所以其正構(gòu)底物結(jié)合位點(diǎn)十分相似。這就導(dǎo)致研發(fā)出的藥物往往對(duì)不同亞型的特異性不夠，造成藥物副作用。別構(gòu)調(diào)節(jié)物指的是不結(jié)合在G蛋白偶聯(lián)受體正構(gòu)底物結(jié)合位點(diǎn)的小分子化合物。其結(jié)合位置通常保守性較低，因此有可能具有更好的特異性。目前報(bào)道的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)大多數(shù)都是結(jié)合了正構(gòu)拮抗劑，只有極少數(shù)結(jié)構(gòu)里面結(jié)合了別構(gòu)調(diào)節(jié)物。布萊恩·克比爾卡教授自從在清華大學(xué)建立實(shí)驗(yàn)室以來(lái)，一直保持和世界上不同實(shí)驗(yàn)室合作，共同研發(fā)G蛋白偶聯(lián)受體的別構(gòu)調(diào)節(jié)物，并利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法研究別構(gòu)調(diào)節(jié)物發(fā)揮功能的分子機(jī)理。
胞內(nèi)別構(gòu)拮抗劑第15號(hào)化合物（Cmpd-15）是羅伯特·萊夫科維茨研究組利用親和篩選的方式，從DNA編碼的小分子化合物庫(kù)里面鑒定出來(lái)的一個(gè)beta2腎上腺素受體別構(gòu)拮抗劑 （Ahn, S. et al. 2017）。生化實(shí)驗(yàn)表明，第15號(hào)化合物可能穿過(guò)細(xì)胞膜，結(jié)合在beta2腎上腺素受體的胞內(nèi)位置。Beta腎上腺素受體的正構(gòu)拮抗劑，即乙型阻滯劑（beta-blocker）是一類(lèi)極為重要的處方藥。而Cmpd-15是第一個(gè)別構(gòu)型的乙型阻滯劑，其重要性不言而喻。
在這項(xiàng)工作中，布萊恩·克比爾卡研究組利用一個(gè)beta2腎上腺素受體和T4溶菌酶的融合蛋白（β2AR-T4L）進(jìn)行晶體學(xué)研究。研究初期利用T4溶菌酶的融合蛋白與Cmpd-15共結(jié)晶，獲得了2.5埃的晶體數(shù)據(jù)。但是由于胞內(nèi)別構(gòu)拮抗劑Cmpd-15溶解性很差，在結(jié)晶條件中最高只能加到200uM。在晶體數(shù)據(jù)里雖然看到胞內(nèi)部分有很弱的電子密度，但是無(wú)法準(zhǔn)確判斷其結(jié)合方式。后來(lái)合作研究組對(duì)Cmpd-15進(jìn)行了修飾，在其上加入一個(gè)羧酸聚乙二醇基團(tuán)以提高其溶解度。改造后的小分子即為Cmpd-15PA。 布萊恩·克比爾卡研究組又獲得了T4溶菌酶的融合蛋白與Cmpd-15PA復(fù)合物2.7埃的晶體結(jié)構(gòu)。其晶體數(shù)據(jù)清楚地揭示了Cmpd-15的結(jié)合方式，羧酸聚乙二醇基團(tuán)在晶體中處于柔性不可見(jiàn)的狀態(tài)。Cmpd-15結(jié)合在跨膜螺旋1、2、6、7的胞內(nèi)端與胞內(nèi)環(huán)1以及螺旋8形成的底物口袋。結(jié)構(gòu)分析、分子動(dòng)態(tài)模擬以及生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cmpd-15通過(guò)兩種方式形成功能：一是通過(guò)穩(wěn)定跨膜螺旋6，將beta2腎上腺素受體穩(wěn)定在非激活狀態(tài)，從而影響正構(gòu)底物的親和力；二是直接與下游信號(hào)蛋白如G蛋白或者抑制蛋白 （arrestin）競(jìng)爭(zhēng)，干擾下游信號(hào)傳導(dǎo)。
beta2腎上腺素受體和Cmpd-15PA結(jié)合的細(xì)節(jié)。
值得注意的是，2016年12月《自然》期刊曾經(jīng)報(bào)道了兩個(gè)趨化因子受體CCR2和CCR9與各自胞內(nèi)別構(gòu)調(diào)節(jié)物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)（Zheng, Y. et al. 2016； Oswald, C. et al. 2016）。盡管小分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)很不一樣，和小分子相互作用的氨基酸序列也不保守，但是本工作中腎上腺素能受體β2抗體 （β2AR）上的第十五化合物結(jié)合區(qū)域和趨化因子受體上的別構(gòu)調(diào)節(jié)物結(jié)合區(qū)域在結(jié)構(gòu)上很接近，都是由跨膜螺旋1、2、6、7的胞內(nèi)部分組成，這表明該位置可能在不同類(lèi)型的G蛋白偶聯(lián)受體里面都可以作為別構(gòu)調(diào)節(jié)物結(jié)合口袋。因而，本工作對(duì)針對(duì)其他G蛋白偶聯(lián)受體的別構(gòu)藥物研發(fā)工作具有指導(dǎo)意義。
本論文是布萊恩·克比爾卡教授與杜克大學(xué)羅伯特·萊夫科維茨教授、常州大學(xué)陳新教授以及斯坦福大學(xué)羅恩·德洛爾（Ron Dror）教授共同合作的成果。其中，布萊恩·克比爾卡教授實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)結(jié)構(gòu)生物學(xué)工作，羅伯特·萊夫科維茨教授實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)生化實(shí)驗(yàn)工作，陳新教授實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)化學(xué)合成工作，羅恩·德洛爾教授實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)分子動(dòng)態(tài)模擬工作。布萊恩·克比爾卡教授與羅伯特·萊夫科維茨教授為本文共同通訊作者。醫(yī)學(xué)院助理研究員劉翔宇博士與杜克大學(xué)佐恩科爾·安（Seungkirl Ahn）博士為本文的共同第一作者。本課題得到北京市結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心的資助。衍射數(shù)據(jù)收集得到日本Spring-8同步輻射光源的支持和協(xié)助。
論文鏈接：
http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature23652
相關(guān)論文：
Ahn, S. et al. Allosteric ‘beta-blocker’ isolated from a DNA-encoded small molecule library. Proc. Natl Acad. Sci. 114, 1708–1713 (2017).
Zheng, Y. et al. Structure of CC chemokine receptor 2 with orthosteric and allosteric antagonists. Nature 540, 458–461 (2016).
Oswald, C. et al. Intracellular allosteric antagonism of the CCR9 receptor. Nature 540, 462–465 (2016).
編輯：悸寔 華山
