清華譚旭研究組合作發(fā)文報(bào)道體內(nèi)靶向基因治療新方法
清華新聞網(wǎng)1月26日電 1月24日，清華大學(xué)譚旭研究組與美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)董一洲研究組合作在《細(xì)胞研究》（Cell Research）上發(fā)表了題為《一種實(shí)現(xiàn)體內(nèi)基因剪切的非病毒性的CRISPR/Cas9輸送系統(tǒng)》(A non-viral CRISPR/Cas9 delivery system for therapeutic gene targeting in viv)，在國(guó)際上首先研發(fā)出一種新型CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,簡(jiǎn)稱(chēng)CRISPR，譯為“規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)體系”)遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠在體內(nèi)遞送CRISPR體系的Cas9蛋白（Cas即為CRISPR-associated, 與規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)體系相關(guān)的）和單鏈引導(dǎo)RNA（sgRNA）至肝臟，從而在單鏈引導(dǎo)RNA的引導(dǎo)下靶向切割外源或內(nèi)源致病基因從而達(dá)到治療肝病的目的。該種新型遞送系統(tǒng)為CRISPR這一強(qiáng)有力的基因編輯工具，在臨床上的實(shí)際應(yīng)用開(kāi)辟了新途徑。
納米脂質(zhì)顆粒能有效的把Cas9 mRNA和針對(duì)乙肝病毒DNA的引導(dǎo)RNA輸送到動(dòng)物的肝細(xì)胞內(nèi)。Cas mRNA隨后被翻譯成 Cas9蛋白，蛋白與引導(dǎo)RNA結(jié)合后特異性的識(shí)別乙肝病毒DNA并對(duì)其進(jìn)行剪切，導(dǎo)致病毒DNA突變或者降解，從而從源頭上降低病毒的水平。
自上世紀(jì)90年代以來(lái)，基因治療逐漸興起，其通過(guò)補(bǔ)償基因缺陷或修正異常致病基因從而達(dá)到治療的目的。CRISPR是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種DNA剪編輯系統(tǒng)，由于其高效特異的DNA剪切和編輯能力在科研領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，而在臨床治療中其應(yīng)用前景也非常值得期待。已有的CRISPR體內(nèi)輸送是通過(guò)運(yùn)用腺病毒表達(dá)體系來(lái)表達(dá)Cas9和sgRNA，就像腺病毒在基因治療歷史中的巨大作用一樣，但也存在諸如腺病毒缺乏靶向性，本身免疫源性較高，病毒在體內(nèi)有一定重組突變機(jī)率等問(wèn)題。而且，腺病毒在細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白，也有可能帶來(lái)長(zhǎng)期的毒副作用。
基于脂質(zhì)納米顆粒的核酸輸送系統(tǒng)已經(jīng)在活體內(nèi)輸送小RNA，如siRNA上表現(xiàn)出良好的效果。譚旭課題組與董一洲研究組合作研發(fā)了一種新型脂質(zhì)納米顆粒系統(tǒng)，可以包裹Cas9蛋白的mRNA以及單鏈引導(dǎo)RNA，并在活體內(nèi)有效的輸送至肝臟并進(jìn)行表達(dá),對(duì)特定致病基因進(jìn)行切割。
為測(cè)試所研發(fā)的新型脂質(zhì)納米顆粒系統(tǒng)的實(shí)際效果，研究組分別選取了以下一個(gè)外源性靶點(diǎn)和一個(gè)內(nèi)源性靶點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試。選擇的外源性靶點(diǎn)是乙肝病毒（HBV）基因組。全球乙肝病毒感染者約有3.5億人，而在中國(guó)，乙肝病毒攜帶也是一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。乙肝病毒難以徹底清除的主要原因是其基因組以一種共價(jià)閉環(huán)DNA（covalently closed circular DNA或cccDNA)形式存在，而現(xiàn)有治療手段均無(wú)法觸及cccDNA；選擇的內(nèi)源性靶點(diǎn)是前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9）是當(dāng)前針對(duì)高膽固醇血癥和其它心血管疾病藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。就目前來(lái)看，針對(duì)PCSK9的藥物主要是抗體類(lèi)藥物，需要長(zhǎng)期多次服用，價(jià)格昂貴。上述二者均有希望通過(guò)編輯其基因序列而達(dá)到治療的目的，故研究組選取此二者為對(duì)象，測(cè)試這種新型的藥物遞送系統(tǒng)。
研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞水平上，經(jīng)這種新型脂質(zhì)納米顆粒（LNP）包裹的Cas9/sgRNA，能夠有效的對(duì)細(xì)胞中HBV cccDNA和Pcsk9基因進(jìn)行切割，并有效的降低HBV相關(guān)抗原的表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種新型脂質(zhì)納米顆粒可以有效遞送Cas9/sgRNA輸送至肝臟進(jìn)行表達(dá)，并且尾靜脈注射6小時(shí)后Cas9蛋白表達(dá)量達(dá)到最大，其后逐步降低，24小時(shí)后消失。在肝臟內(nèi)，所遞送的Cas9/sgRNA能對(duì)內(nèi)外源基因序列進(jìn)行有效的特異性剪切，進(jìn)而降低相關(guān)蛋白的表達(dá)量。一次注射能有效降低乙肝病毒表達(dá)量50％以上。國(guó)際審稿人認(rèn)為這項(xiàng)工作是本領(lǐng)域激動(dòng)人心的成果，對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)未來(lái)的臨床轉(zhuǎn)化研究有重要意義。
論文通訊作者為譚旭和董一洲。清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生蔣超、梅淼，俄亥俄州大學(xué)博士后李斌、清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士生朱修銳為共同第一作者。清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系的郭永課題組也有重要貢獻(xiàn)。該工作得到了科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃，生命科學(xué)聯(lián)合中心和美國(guó)蓋茨基金會(huì)的資助。
文章鏈接：
http://www.nature.com/cr/journal/vaop/ncurrent/full/cr201716a.html
供稿：藥學(xué)院 編輯：華山 襄樺
