清華新聞網(wǎng)9月22日電 近期，清華大學(xué)生命學(xué)院方顯楊課題組與美國(guó)南加州大學(xué)化學(xué)系Peter Z. Qin教授課題組針對(duì)現(xiàn)有長(zhǎng)鏈RNA位點(diǎn)特異性自旋標(biāo)記技術(shù)的局限性，合作建立了長(zhǎng)鏈RNA位點(diǎn)特異性自旋標(biāo)記新方法及其應(yīng)用。該標(biāo)記策略的成功建立將促進(jìn)電子順磁共振技術(shù)在長(zhǎng)鏈RNA的結(jié)構(gòu)與動(dòng)態(tài)特性研究中的應(yīng)用，并推動(dòng)建立長(zhǎng)鏈RNA的整合結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究方案。
電子順磁共振技術(shù)（Electron Paramagnetic Resonance, EPR）與核磁共振技術(shù)（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）類(lèi)似，都是磁共振波譜學(xué)技術(shù)的分支。近年來(lái)，位點(diǎn)特異性自旋標(biāo)記電子順磁共振技術(shù)（Site-Directed Spin Labeling Electron Paramagnetic Resonance, SDSL-EPR）已成為研究生物大分子（包括蛋白質(zhì), DNA, RNA等）的結(jié)構(gòu)、動(dòng)態(tài)特性與功能的重要技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)能夠在近生理?xiàng)l件下探測(cè)生物大分子不同功能狀態(tài)下的動(dòng)態(tài)特性信息、提供自旋中心間20-100埃的距離信息、并且實(shí)時(shí)的檢測(cè)生物大分子的構(gòu)象變化過(guò)程等。SDSL-EPR具有靈敏度高（相比于核磁共振）, 對(duì)生物大分子的分子量和均一性均沒(méi)有限制的優(yōu)點(diǎn)，SDSL-EPR已日益成為重要的整合結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究工具。
由于大多數(shù)生物大分子是天然逆磁性的，開(kāi)展SDSL-EPR研究的前提是向生物大分子特定位點(diǎn)引入一個(gè)或成對(duì)的自旋標(biāo)記，這些自旋標(biāo)記可以是自由基或順磁金屬離子。當(dāng)前，蛋白質(zhì)的位點(diǎn)特異性自旋標(biāo)記技術(shù)已有很好的發(fā)展而相對(duì)成熟，而RNA，特別是長(zhǎng)鏈RNA的位點(diǎn)特異性自旋標(biāo)記仍十分具有挑戰(zhàn)性。例如，基于固相化學(xué)合成的標(biāo)記方法主要局限于長(zhǎng)度在100個(gè)核苷酸以下的短鏈RNA；基于DNA夾板指導(dǎo)的酶促連接法可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)鏈RNA的位點(diǎn)特異性自旋標(biāo)記，但其步驟往往十分繁瑣，還需要經(jīng)歷變性復(fù)性過(guò)程，該方法不僅效率低，其變性過(guò)程常常導(dǎo)致長(zhǎng)鏈RNA的不可逆錯(cuò)誤折疊。
方顯楊課題組利用包含NaM-TPT3非天然堿基對(duì)的系統(tǒng)，通過(guò)化學(xué)合成堿基帶有炔基修飾的TPT3（rTPT3CO）（圖1A），經(jīng)過(guò)PCR和體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在RNA中位點(diǎn)特異性的引入TPT3CO，進(jìn)一步利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的高選擇性，通過(guò)與疊氮基修飾的氮氧自由基化合物反應(yīng)，建立了在非變性條件下長(zhǎng)鏈RNA位點(diǎn)特異性自旋標(biāo)記的策略，并成功應(yīng)用于長(zhǎng)度為419核苷酸的核糖核酸酶RNAse P的位點(diǎn)特異性自旋標(biāo)記中（圖1B）。通過(guò)與Peter Z. Qin教授課題組合作，應(yīng)用連續(xù)波（CW）EPR 技術(shù)證實(shí)了該方法的高標(biāo)記效率、 研究了標(biāo)記位點(diǎn)附近的動(dòng)態(tài)特性、以及用雙電子自旋共振（DEER） EPR技術(shù)測(cè)定了成對(duì)自旋中心間的距離（圖1C），實(shí)現(xiàn)了其在電子順磁共振技術(shù)中的應(yīng)用。
圖1 基于非天然堿基對(duì)系統(tǒng)的長(zhǎng)鏈RNA位點(diǎn)特異性自旋標(biāo)記方案及其在電子順磁共振中的應(yīng)用
近日，基于上述工作，清華大學(xué)生命學(xué)院方顯楊課題組與美國(guó)南加州大學(xué)化學(xué)系Peter Z. Qin教授課題組合作在《化學(xué)科學(xué)》（Chemical Science）雜志發(fā)表了題為“基于非天然堿基對(duì)系統(tǒng)的非變性條件下長(zhǎng)鏈RNA轉(zhuǎn)錄后位點(diǎn)特異性自旋標(biāo)記技術(shù)”（Posttranscriptional site-directed spin labeling of large RNAs with an unnatural base pair system under non-denaturing conditions）的文章。
方顯楊研究員與Peter Z. Qin教授為該文的共同通訊作者。清華大學(xué)2016級(jí)直博生王巖為該文的第一作者。南加州大學(xué)化學(xué)系博士后Venkatesan Kathiresan、博士生Wei Jiang參與了DEER EPR數(shù)據(jù)采集；清華大學(xué)生命學(xué)院2014級(jí)本科生陳垚宜（現(xiàn)在德國(guó)柏林自由大學(xué)攻讀博士學(xué)位）、2017級(jí)直博生胡艷萍參與了研究工作；北京大學(xué)藥學(xué)院化學(xué)生物系研究員劉國(guó)全、博士生白光燦在CW EPR數(shù)據(jù)收集方面提供了大力幫助。該項(xiàng)目受到國(guó)家自然科學(xué)基金委大科學(xué)裝置科學(xué)研究聯(lián)合基金重點(diǎn)支持項(xiàng)目、北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心的經(jīng)費(fèi)支持。
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https://doi.org/10.1039/D0SC01717E
供稿：生命學(xué)院
編輯：李晨暉
審核：程曦
