清華新聞網(wǎng)11月2日電 近日，清華大學(xué)藥學(xué)院王建偉團(tuán)隊(duì)解析了衰老進(jìn)程中DNMT3A hR882H/mR878H突變導(dǎo)致造血干細(xì)胞克隆性增生的分子生物學(xué)機(jī)制，并篩選出冬凌草甲素能夠選擇性的抑制攜帶DNMT3A R882突變的造血干細(xì)胞的克隆性造血能力以及急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的成瘤能力。
克隆性造血屬于血液腫瘤的癌前病變狀態(tài)，它具有以下四個(gè)特點(diǎn)：血液細(xì)胞攜帶白血病相關(guān)基因的突變、突變頻率大于2%、這些突變主要擴(kuò)增造血干細(xì)胞（Hematopoietic stem cell, HSC）及祖細(xì)胞、攜帶這些突變的病人還沒(méi)有轉(zhuǎn)化為白血病。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，克隆性造血會(huì)隨著個(gè)體的衰老而不斷加劇，因而也被稱(chēng)為衰老相關(guān)克隆性造血。克隆性造血的個(gè)體發(fā)生白血病的風(fēng)險(xiǎn)較正常人增加了10倍，并出現(xiàn)髓系細(xì)胞分化偏向性，從而導(dǎo)致系統(tǒng)性慢性炎癥，進(jìn)而使得炎癥相關(guān)疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死以及中風(fēng)的發(fā)生率提高了約1倍。而全身性的慢性炎癥反過(guò)來(lái)加劇克隆性造血的進(jìn)展，從而形成一個(gè)惡性循環(huán)（圖1）。
圖1 克隆性造血、慢性炎癥和心管疾病之間的聯(lián)系
克隆性造血發(fā)生率隨著年齡增大而增加，并伴隨著很多關(guān)鍵基因的突變，其中DNMT3A在多個(gè)研究中都顯示為突變頻率最高的基因。DNMT3A可測(cè)到的突變位點(diǎn)多達(dá)190個(gè)，其中R882位點(diǎn)突變?cè)诳寺⌒栽煅獋€(gè)體中占17%，在急性髓系白血病（AML）個(gè)體中占比高達(dá)50%。由于克隆性造血為白血病的癌前病變狀態(tài)，由此說(shuō)明攜帶R882突變的克隆性造血患者更容易轉(zhuǎn)化為白血病。此外，攜帶DNMT3A突變的白血病病人生存率明顯下降，這種不良的預(yù)后主要與DNMT3A突變細(xì)胞對(duì)臨床常用的蒽環(huán)類(lèi)化療藥產(chǎn)生耐藥性相關(guān)。那么，DNMT3A 突變頻率隨著衰老不斷增加的分子機(jī)制是什么？是否存在針對(duì)DNMT3A突變細(xì)胞的小分子抑制劑？
研究團(tuán)隊(duì)分別將年輕的R878H骨髓細(xì)胞連同正常的競(jìng)爭(zhēng)者骨髓細(xì)胞移植到年輕與年老的受體小鼠中。結(jié)果顯示，R878H骨髓細(xì)胞在年老受體小鼠中重建率更高，而WT細(xì)胞則沒(méi)有明顯差異（圖2），說(shuō)明年老的骨髓微環(huán)境促進(jìn)了R878H誘導(dǎo)的克隆性造血。那么到底是年老骨髓中什么因素促進(jìn)了R878H細(xì)胞的克隆性擴(kuò)增呢？
圖2 衰老的骨髓促進(jìn)DNMT3A R878H驅(qū)動(dòng)的克隆性造血
近些年來(lái)，普遍認(rèn)為衰老與炎癥密切相關(guān)，因此有了炎性衰老（Inflamm-aging）的概念。那么，R878H細(xì)胞在年老骨髓中的克隆性擴(kuò)增是否與年老的骨髓炎癥微環(huán)境增強(qiáng)相關(guān)呢？為此，研究團(tuán)隊(duì)分別用LPS模擬急性和慢性炎癥刺激。發(fā)現(xiàn)R878H HSC對(duì)于急性炎癥刺激的響應(yīng)明顯下降，而慢性炎癥刺激可以促進(jìn)R878H細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的克隆性造血（圖3）。
圖3 LPS誘導(dǎo)的慢性炎癥促進(jìn)R878H驅(qū)動(dòng)的克隆性造血
研究團(tuán)隊(duì)分別取年輕和年老受體小鼠的骨髓上清做細(xì)胞因子芯片分析，發(fā)現(xiàn)其中TNFα信號(hào)通路在年老骨髓中顯著上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，R878H HSC可以抵抗TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷（圖4），證明TNFα是年老骨髓微環(huán)境中促進(jìn)R878H細(xì)胞克隆性擴(kuò)增的主要炎癥因子。
圖4 R878H HSC抵抗TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷
研究團(tuán)隊(duì)將年老受體骨髓中的LSK細(xì)胞分選出來(lái)做RT-PCR，分別檢測(cè)TNFα信號(hào)下游相關(guān)的通路基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)凋亡通路的Fadd和Caspase-8以及細(xì)胞程序性壞死通路的Ripk1和Ripk3表達(dá)下降（圖5），說(shuō)明凋亡和程序性壞死通路在R878H細(xì)胞中受到了抑制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，R878H細(xì)胞能夠部分抵抗細(xì)胞程序性壞死，而不是凋亡（圖5），說(shuō)明Dnmt3a R878H細(xì)胞通過(guò)抵抗細(xì)胞程序性壞死的激活而獲得增殖優(yōu)勢(shì)。
圖5 Dnmt3a R878H細(xì)胞抵抗細(xì)胞程序性壞死激活
為篩選針對(duì)DNMT3A R882 / Dnmt3a R878突變的小分子抑制劑，研究團(tuán)隊(duì)首先構(gòu)建DNMT3A R882H突變細(xì)胞系，并在該細(xì)胞系的AAVS1位點(diǎn)定點(diǎn)敲入一個(gè)紅色熒光報(bào)告基因tdTomato，同時(shí)在WT細(xì)胞的同樣位點(diǎn)敲入EGFP基因。研究團(tuán)隊(duì)將兩種細(xì)胞按1：1共培養(yǎng)，并加入小分子處理2天后用高通量流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種細(xì)胞的比例。結(jié)果顯示，冬凌草甲素為R882H細(xì)胞的選擇性抑制小分子（圖6）。
圖6 DNMT3A R882H細(xì)胞系的構(gòu)建及小分子篩選策略
冬凌草甲素作用于R882H細(xì)胞的IC50值約為WT細(xì)胞的一半，并且相對(duì)于攜帶其他克隆性造血突變基因的細(xì)胞系，冬凌草甲素對(duì)DNMT3A突變細(xì)胞系（OCI-AML3）的抑制作用呈現(xiàn)選擇性。進(jìn)一步研究表明，冬凌草甲素抑制OCI-AML3細(xì)胞的生長(zhǎng)通過(guò)同時(shí)激活細(xì)胞凋亡與程序性壞死。
圖7 冬凌草甲素誘導(dǎo)DNMT3A突變細(xì)胞發(fā)生凋亡與程序性壞死
此外，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素能顯著抑制OCI-AML3細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)，并且能顯著抑制DNMT3A R878H驅(qū)動(dòng)的克隆性造血，而對(duì)WT細(xì)胞沒(méi)有影響（圖8）。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，冬凌草甲素同時(shí)誘導(dǎo)R878H HSC發(fā)生凋亡和程序性壞死。
圖8 冬凌草甲素誘導(dǎo)R878H HSC發(fā)生凋亡和程序性壞死
冬凌草甲素抑制DNMT3A突變驅(qū)動(dòng)的克隆性造血及白血病部分研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)申請(qǐng)了PCT專(zhuān)利一項(xiàng)。此外，由于以冬凌草甲素為主要成分的中藥冬凌草已經(jīng)是一個(gè)經(jīng)國(guó)家藥監(jiān)局批準(zhǔn)的抗炎中成藥，研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)開(kāi)展臨床試驗(yàn)，將冬凌草片用于DNMT3A突變白血病的研究中。
以上系統(tǒng)性地從DNMT3A R878H小鼠模型的構(gòu)建，到DNMT3A R882突變引發(fā)衰老相關(guān)克隆性造血的機(jī)制研究，再到抑制DNMT3A R882突變驅(qū)動(dòng)的克隆性造血的小分子抑制劑的研究，對(duì)DNMT3A突變及其他相關(guān)突變驅(qū)動(dòng)的克隆性造血及白血病研究具有一定的指導(dǎo)意義，為尋找相關(guān)突變誘發(fā)的白血病與克隆性造血的潛在小分子抑制劑提供了參考。
以上研究成果以?xún)善芯空撐牡男问椒謩e發(fā)表：在藥學(xué)專(zhuān)業(yè)期刊《藥學(xué)學(xué)報(bào)》（Acta Pharmaceutica Sinica B）發(fā)表題為“衰老上調(diào)的炎癥促進(jìn)DNMT3AR878H驅(qū)動(dòng)的克隆造血”（Aging-elevated inflammation promotes DNMT3A R878H-driven clonal hematopoiesis）的研究論文；在細(xì)胞死亡領(lǐng)域?qū)I(yè)期刊《細(xì)胞死亡發(fā)現(xiàn)》（Cell Death Discovery）發(fā)表題為“冬凌草甲素通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和程序性壞死抑制DNMT3A R882突變驅(qū)動(dòng)的克隆造血和白血病”（Oridonin inhibits DNMT3A R882 mutation-driven clonal hematopoiesis and leukemia by inducing apoptosis and necroptosis）的研究論文。
王建偉實(shí)驗(yàn)室2017級(jí)博士研究生廖敏為這兩篇文章的獨(dú)立第一作者，第一篇文章中王建偉研究員和浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院的姜虹博士為共同通訊作者，第二篇文章中王建偉研究員、浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院的姜虹博士和首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院的孫婉玲博士為共同通訊作者。此外，多家單位的多位老師和學(xué)生也給與了很多幫助，在此一并表示感謝。本項(xiàng)目受到了國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、北京市科委項(xiàng)目及清華大學(xué)-北京大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合中心（Tsinghua-Peking Center for Life Sciences）的資助。
論文鏈接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211383521003579
https://www.nature.com/articles/s41420-021-00697-5#author-information
供稿：藥學(xué)院
標(biāo)題圖設(shè)計(jì)：趙存存
編輯：李華山
審核：田姬熔
