清華新聞網(wǎng)12月16日電 近年來(lái)，腫瘤類(lèi)器官（Patient-derived tumor organoids, PDOs）發(fā)展成為研究病人藥物響應(yīng)及其內(nèi)在作用機(jī)制的有力體外模型。然而，PDOs用于藥物篩選仍然存在兩大問(wèn)題：一是PDOs起始量少，且構(gòu)建困難，難以用于大規(guī)模高通量分析；二是基于PDOs的藥篩往往只依賴(lài)于表型（如藥敏曲線(xiàn)）等，缺乏對(duì)藥物作用機(jī)制研究的數(shù)據(jù)，制約了藥物進(jìn)一步的改造和應(yīng)用。
為了解決上述兩大問(wèn)題，劉鵬課題組通過(guò)六年時(shí)間的努力，成功研發(fā)出Grouped-seq（genome-wide RNA output unified with phenotypic data sequencing）平臺(tái)，為PDOs藥篩提供多元化的工具。12月10日，醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系劉鵬研究員課題組聯(lián)合北京航空大學(xué)陳曉芳副教授課題組在學(xué)術(shù)期刊《核酸研究》（Nucleic Acids Research）上在線(xiàn)發(fā)表題為“用于腫瘤類(lèi)器官表型與表達(dá)譜聯(lián)合分析的高通量藥物篩選技術(shù)Grouped-seq”（Grouped-seq for integrated phenotypic and transcriptomic screening of patient-derived tumor organoids）的研究論文，報(bào)道了能夠高通量、低成本的從微量腫瘤類(lèi)器官同時(shí)獲得表型和對(duì)應(yīng)表達(dá)譜變化的新技術(shù)。該平臺(tái)為腫瘤類(lèi)器官的高通量藥物篩選提供了一個(gè)多元化的有力工具，讓精準(zhǔn)藥物開(kāi)發(fā)與測(cè)試成為可能。
首先，Grouped-seq利用超疏水微孔陣列芯片作為PDOs操作的載體，不但能夠滿(mǎn)足低起始量樣本的高通量操作需求，還大大提高了平臺(tái)的靈敏性和重復(fù)性。其次，Grouped-seq在獲取PDOs表型數(shù)據(jù)的同時(shí)，還得到了對(duì)應(yīng)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，兩種數(shù)據(jù)相輔相成，有助于更加精準(zhǔn)地判斷藥物的作用效果，甚至推斷藥物的作用機(jī)制。
Grouped-seq平臺(tái)的操作流程如圖1所示。首先將細(xì)胞或者類(lèi)器官均勻載入超疏水微孔陣列芯片的各個(gè)微孔中，而后在微孔的不同位置加入不同種類(lèi)或濃度的藥物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行高通量處理，之后利用成像技術(shù)獲取細(xì)胞的表型信息，然后通過(guò)磁珠編碼探針復(fù)合物將每個(gè)微坑中細(xì)胞的mRNA進(jìn)行編碼，最后將磁珠回收到管中完成后續(xù)的建庫(kù)、測(cè)序、數(shù)據(jù)分析等一系列的操作。由于預(yù)先用編碼探針對(duì)不同微坑的細(xì)胞進(jìn)行了標(biāo)記，測(cè)序得到的數(shù)據(jù)便可根據(jù)標(biāo)記拆分，繼而與先前的表型信息匹配，整合后進(jìn)行多組學(xué)分析。
圖1.Grouped-seq概念及其基于超疏水微孔陣列芯片的分析流程
本研究利用結(jié)直腸癌類(lèi)器官對(duì)Grouped-seq平臺(tái)進(jìn)行了驗(yàn)證（圖2）。實(shí)驗(yàn)中，選取了結(jié)直腸癌臨床上常用的四種藥物，每種藥物設(shè)置8個(gè)濃度，每種濃度設(shè)置5個(gè)重復(fù)，利用Grouped-seq得到表型信息和對(duì)應(yīng)的表達(dá)譜信息，將二者聯(lián)合后進(jìn)行分析。表型結(jié)果顯示，伊立替康、奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶是兩種有效藥，因?yàn)樵谒幬锔邼舛茸饔孟拢?xì)胞活力下降明顯。與之對(duì)應(yīng)的，兩種有效藥高濃度的表達(dá)譜較對(duì)照組差別也是最大的。由此在宏觀(guān)上證明了表型和表達(dá)譜是統(tǒng)一的，二者共同揭示藥物的作用效果。
圖2.PDOs藥篩表型與轉(zhuǎn)錄型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
進(jìn)一步地，本研究對(duì)藥物伊立替康的用藥機(jī)制進(jìn)行了更加深入的探究（圖3）。研究將篩選到的核心差異基因列出，并根據(jù)其隨藥物濃度變化順序分成三個(gè)階段，即分別在低、中、高濃度發(fā)生顯著變化的基因集。之后，再將這些不同階段的基因映射回通路，并計(jì)算各通路中各階段基因的占比。研究發(fā)現(xiàn)，藥物首先影響的是DNA構(gòu)象改變的相關(guān)通路，之后影響到細(xì)胞凋亡的相關(guān)通路，這與伊立替康的作用機(jī)制符合。由此，Grouped-seq正確解析出了伊立替康作用于腫瘤類(lèi)器官的藥物作用機(jī)制。
圖3：Grouped-seq解析藥物伊立替康的用藥效果
與傳統(tǒng)分析技術(shù)相比，Grouped-seq主要有以下三個(gè)方面的提升。第一，開(kāi)發(fā)了一個(gè)納升級(jí)別的高通量微流控平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了包括細(xì)胞培養(yǎng)、成像、測(cè)序等一系列的靈活操作。第二，設(shè)計(jì)了一套低成本的細(xì)胞編碼體系，保證測(cè)序數(shù)據(jù)能夠回溯到對(duì)應(yīng)樣本，從而令表達(dá)譜數(shù)據(jù)與表型數(shù)據(jù)一一對(duì)應(yīng)。第三，編寫(xiě)了一套表型輔助表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析的算法，利用有監(jiān)督的表型數(shù)據(jù)指導(dǎo)無(wú)監(jiān)督的表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析。總的來(lái)說(shuō)，Grouped-seq在保證試驗(yàn)準(zhǔn)確和數(shù)據(jù)質(zhì)量的同時(shí)，能夠以1/10的樣本量和試劑用量進(jìn)行試驗(yàn)，單個(gè)RNA-seq成本降至傳統(tǒng)試驗(yàn)的1/100（2美元）。低成本、高通量、高質(zhì)量、有監(jiān)督等優(yōu)點(diǎn)使得Grouped-seq有望被廣泛應(yīng)用于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和藥物篩選等眾多場(chǎng)景。
清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院2017級(jí)博士生吳俁帥為論文的第一作者，北京大學(xué)第三附屬醫(yī)院孫濤教授參與了本研究工作，劉鵬研究員、陳曉芳副教授為該論文通訊作者。
論文鏈接：
https://academic.oup.com/nar/advance-article-abstract/doi/10.1093/nar/gkab1201/6459086
供稿：醫(yī)學(xué)院
編輯：李華山
審核：田姬熔
