清華新聞網(wǎng)10月10日電 近日，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院饒子和教授、婁智勇教授團(tuán)隊(duì)與廣州實(shí)驗(yàn)室、上海科技大學(xué)等單位合作，在新冠病毒中發(fā)現(xiàn)了一種生物界中全新的RNA加帽途徑，闡明核苷類(lèi)抗病毒藥物抑制該過(guò)程的分子機(jī)制，并提出全新的“induce-and-lock”的藥物設(shè)計(jì)機(jī)制。這是該團(tuán)隊(duì)在病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制機(jī)制的研究中，繼在2020年、2021年在《科學(xué)》（Science）、《細(xì)胞》（Cell）期刊上連續(xù)發(fā)表五項(xiàng)相關(guān)成果后的又一重要的系統(tǒng)性工作。
“帽”（Cap）結(jié)構(gòu)是細(xì)胞中廣泛存在的一種RNA修飾。細(xì)胞中的一系列酶分子，通過(guò)復(fù)雜的催化過(guò)程，在RNA 5’端前加入一個(gè)G核苷，形成“帽核心”結(jié)構(gòu)（cap core，GpppN），再由甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)第一、第二、第三個(gè)核苷的不同位置進(jìn)行甲基化，最終形成Cap0、Cap1、Cap2結(jié)構(gòu)（圖1）。在高等生物細(xì)胞中，Cap1是最主要的“帽”結(jié)構(gòu)形式。
“帽”結(jié)構(gòu)在細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮著關(guān)鍵功能。例如，在高等生物細(xì)胞中，“帽”結(jié)構(gòu)可以維持mRNA的穩(wěn)定性，防止核酸酶對(duì)mRNA的破壞，并可通過(guò)帽結(jié)合蛋白（cap binding protein）參與mRNA與核糖體的識(shí)別，調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯的順利進(jìn)行。作為必須在宿主細(xì)胞中表現(xiàn)生命活性的病毒而言，在其生命活動(dòng)中，會(huì)通過(guò)宿主或病毒自身編碼的蛋白質(zhì)，對(duì)病毒mRNA進(jìn)行加帽，其結(jié)構(gòu)與細(xì)胞中的“帽”結(jié)構(gòu)完全相同，除了保證病毒蛋白質(zhì)的順利翻譯，還可以使宿主將病毒mRNA“誤認(rèn)為”是宿主核酸分子，從而逃逸宿主天然免疫的攻擊。
圖1. 帽（Cap）結(jié)構(gòu)
病毒是一種相對(duì)簡(jiǎn)單的生命形式，是生命科學(xué)研究的重要對(duì)象，許多重要的生物學(xué)概念和生物技術(shù)的發(fā)展都離不開(kāi)對(duì)病毒的認(rèn)識(shí)，如RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)、冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展、基因治療載體技術(shù)等，都來(lái)源于對(duì)病毒的研究。新冠病毒是目前已知RNA病毒中基因組最大的一種病毒（約30kb），在其基因組RNA和mRNA的5’端也必須具備Cap1“帽”結(jié)構(gòu)。在病毒學(xué)傳統(tǒng)認(rèn)知中，冠狀病毒核酸的“加帽過(guò)程”通過(guò)四步反應(yīng)過(guò)程完成（圖2，左側(cè)）：第一步，解旋酶（nsp13）將新生核酸5’端三磷酸末端水解掉一個(gè)磷酸基團(tuán)，生成二磷酸末端；第二步，聚合酶NiRAN結(jié)構(gòu)域在二磷酸末端上加入一個(gè)GMP分子，生成帽核心結(jié)構(gòu)（GpppA）；第三步，nsp14蛋白的N7甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行第一步甲基化，形成Cap0結(jié)構(gòu)（7MeGpppA）；第四步，nsp16蛋白的進(jìn)行第二步甲基化，形成成熟的Cap1結(jié)構(gòu)（7MeGpppA2’-OMe）。其中，聚合酶NiRAN結(jié)構(gòu)域在第二步反應(yīng)的核心功能，以及nsp14蛋白催化第三步反應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是研究團(tuán)隊(duì)在2020年和2021年在《細(xì)胞》期刊上連續(xù)發(fā)表兩篇論文揭示的。
圖2. 新冠病毒RNA加帽的傳統(tǒng)機(jī)制（左側(cè)）和本工作發(fā)現(xiàn)的新機(jī)制（右側(cè)）
圍繞新冠病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程，研究團(tuán)隊(duì)自新冠疫情發(fā)生后開(kāi)展了系統(tǒng)研究，先后闡明了“核心轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體”（C-RTC）、“延伸轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體”（E-RTC）、“加帽中間態(tài)轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體”和“Cap0轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體”的工作機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步深入探索了新冠病毒核酸加帽的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新冠病毒能夠利用其轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體中的單鏈核酸結(jié)合蛋白nsp9作為媒介，介導(dǎo)全新的加帽過(guò)程（圖2，右側(cè)）。
該過(guò)程分為兩個(gè)階段（圖3）。第一階段，聚合酶NiRAN結(jié)構(gòu)域水解新生核酸鏈5’三磷酸末端成為單磷酸末端，并將剩余的單磷酸末端與nsp9蛋白N端第一個(gè)氨基酸（Asn1）的氨基共價(jià)連接，形成RNA-nsp9中間產(chǎn)物，該過(guò)程被命名為“RNAylation”過(guò)程。第二階段，聚合酶NiRAN在其“G口袋”中結(jié)合一個(gè)GTP分子，誘導(dǎo)NiRAN結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象變化，將一個(gè)稱(chēng)之為“斷鍵水分子”的水分子向RNA與nsp9共價(jià)鍵的距離推進(jìn)至3.8?，使其發(fā)揮親和攻擊能力，導(dǎo)致RNA與nsp9間的共價(jià)鍵斷裂，再由斷鍵形成的高能基團(tuán)攻擊GTP，最終形成帽核心結(jié)構(gòu)（GpppA）。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，不僅是對(duì)新冠病毒乃至其他病毒生命過(guò)程理解的重要更新，而且在生物學(xué)領(lǐng)域中也是第一次發(fā)現(xiàn)這種由蛋白質(zhì)作為媒介來(lái)介導(dǎo)的RNA加帽過(guò)程，拓展了生命科學(xué)研究中對(duì)核酸加工的認(rèn)識(shí)邊界，為在人體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)可能存在的類(lèi)似現(xiàn)象提供了一個(gè)重要的起點(diǎn)。
圖3. 新冠病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體與RNA-nsp9的復(fù)合體結(jié)構(gòu)（上）與加帽新機(jī)制（下）
研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，核苷類(lèi)抗病毒藥物能夠被聚合酶NiRAN結(jié)構(gòu)域，通過(guò)類(lèi)似的機(jī)制共價(jià)連接到nsp9蛋白，進(jìn)而阻止了加帽反應(yīng)過(guò)程。尤其特殊的是，當(dāng)核苷類(lèi)抗病毒藥物索非布韋（sofosbuvir）連接到nsp9蛋白后，藥物分子結(jié)合在一個(gè)稱(chēng)之為“Nuc口袋”的位點(diǎn)，并通過(guò)其核糖基團(tuán)上的化學(xué)修飾，誘導(dǎo)NiRAN結(jié)構(gòu)的“S-loop”發(fā)生劇烈的構(gòu)象改變，封閉“G口袋”中GTP分子進(jìn)出的路徑（圖4）。這一系列發(fā)現(xiàn)，不但為認(rèn)識(shí)核苷類(lèi)抗病毒藥物的作用機(jī)制提供了全新視角，還為我們展示了一種“induce-and-lock”的全新的藥物設(shè)計(jì)機(jī)制，為進(jìn)一步發(fā)展高親和力、全新的抗病毒藥物提供了一個(gè)全新的角度。
圖4. 索非布韋與S-loop的作用（左）、S-loop封閉G口袋的機(jī)制（右）
10月4日，該成果發(fā)表在《細(xì)胞》(Cell)期刊上，文章名稱(chēng)為“新型冠狀病毒RNA加帽過(guò)程新機(jī)制及核苷類(lèi)似物對(duì)其抑制機(jī)制的研究”(A mechanism for SARS-CoV-2 RNA capping and its inhibition by nucleotide analogue inhibitors)。
該成果的獲得得益于研究團(tuán)隊(duì)在冠狀病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制領(lǐng)域中19年來(lái)的長(zhǎng)期積累。自2020年，研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)研究了新冠病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程，闡明了關(guān)鍵藥物靶點(diǎn)蛋白主蛋白酶Mpro和轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體多個(gè)狀態(tài)三維結(jié)構(gòu)，為認(rèn)識(shí)病毒的生命過(guò)程、發(fā)展高效抗病毒藥物提供了關(guān)鍵信息，先后在《自然》（Nature）、《科學(xué)》（Science）、《細(xì)胞》（Cell）上和《自然·通訊》（Nature Communications）上發(fā)表系列研究論文，是國(guó)際上新冠病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制研究中最為系統(tǒng)、引用最多的工作之一，被評(píng)為“2021年度中國(guó)科學(xué)十大進(jìn)展”“2021年度中國(guó)生命科學(xué)領(lǐng)域十大進(jìn)展”“中國(guó)2021年度醫(yī)學(xué)重要進(jìn)展”等。
清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授饒子和、婁智勇和上?？萍即髮W(xué)博士高巖為共同通訊作者，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士閆利明、2018級(jí)博士生黃羽岑、博士葛基、2019級(jí)博士生劉震宇為共同第一作者。
論文鏈接：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(22)01256-9
供稿：醫(yī)學(xué)院
題圖設(shè)計(jì)：李娜
編輯：李華山
審核：郭玲
