清華新聞網(wǎng)11月16日電 近日，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院李海濤教授實(shí)驗(yàn)室與賓夕法尼亞大學(xué)萬(wàn)里玲助理教授實(shí)驗(yàn)室合作，運(yùn)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等手段揭示出表觀(guān)因子ENL熱點(diǎn)突變通過(guò)引發(fā)異常轉(zhuǎn)錄凝聚體促癌的分子病理機(jī)制。該研究首次發(fā)現(xiàn)“脯氨酸凸起”結(jié)構(gòu)基序在讀碼器結(jié)構(gòu)域ENL YEATS中具有抑制異常相分離進(jìn)而防止癌癥發(fā)生的作用。
基因表達(dá)的精準(zhǔn)調(diào)控是保證正常發(fā)育和維持組織穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)。目前已知許多基因調(diào)控蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子、 組蛋白、表觀(guān)調(diào)控因子等）在腫瘤中頻繁突變，且這些突變能夠驅(qū)動(dòng)原癌基因表達(dá)，但是具體的分子機(jī)制在很多情況下依然不清楚。Eleven-Nineteen-Leukemia（ENL）蛋白是一類(lèi)表觀(guān)調(diào)控因子，可以通過(guò)其氨基端的YEATS結(jié)構(gòu)域特異識(shí)別組蛋白乙?；揎?，從而招募組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L或者超級(jí)延伸復(fù)合物SEC等促進(jìn)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。2014年，李海濤與石曉冰實(shí)驗(yàn)室在《細(xì)胞》期刊發(fā)表合作文章，首次揭示YEATS結(jié)構(gòu)域是一類(lèi)全新折疊類(lèi)型的組蛋白?；x碼器。隨后圍繞人源四個(gè)YEATS家族蛋白（AF9，ENL，YEATS2，GAS41），李海濤實(shí)驗(yàn)室與合作者開(kāi)展了一系列結(jié)構(gòu)與功能研究，闡明了YEATS家族成員在巴豆?；⒈郊柞；确且阴；；R(shí)別，以及腫瘤發(fā)生、炎癥反應(yīng)、干細(xì)胞分化等過(guò)程中的機(jī)制和作用，并實(shí)現(xiàn)了數(shù)個(gè)小分子抑制劑的開(kāi)發(fā)。ENL是混合譜系白血病（Mixed lineage leukemia, MLL）染色體異位發(fā)生基因融合的常見(jiàn)伙伴基因，由此引發(fā)的白血病在幼兒病患中很常見(jiàn)且比較惡性，預(yù)后效果差。同時(shí)，外顯子組測(cè)序在腎母細(xì)胞瘤（Wilms tumor）、乳腺癌、肺癌等病患樣本中發(fā)現(xiàn)了多種類(lèi)型的YEATS結(jié)構(gòu)域基因突變。萬(wàn)里玲與合作者于2017和2019年在《自然》期刊先后發(fā)表兩篇文章，分別揭示ENL是驅(qū)動(dòng)急性白血病發(fā)生的關(guān)鍵因子，并證明ENL的YEATS結(jié)構(gòu)域是一類(lèi)重要的治療急性白血病的藥物靶標(biāo)；以及發(fā)現(xiàn)ENL YEATS熱點(diǎn)突變通過(guò)增強(qiáng)ENL自我聚集促進(jìn)其在靶基因的富集，進(jìn)而激活原癌基因并導(dǎo)致癌癥發(fā)生。
李海濤實(shí)驗(yàn)室與萬(wàn)里玲實(shí)驗(yàn)室合作在《分子細(xì)胞》（Molecular Cell）期刊發(fā)表封面文章“結(jié)構(gòu)性ENL YEATS結(jié)構(gòu)域熱點(diǎn)突變關(guān)聯(lián)異常轉(zhuǎn)錄凝聚體與癌癥”（Hotspot mutations in the structured ENL YEATS domain link aberrant transcriptional condensates and cancer）。文章中，研究者系統(tǒng)運(yùn)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等手段揭示出表觀(guān)因子ENL熱點(diǎn)突變通過(guò)引發(fā)異常轉(zhuǎn)錄凝聚體促癌的分子病理機(jī)制。該工作首次發(fā)現(xiàn)“脯氨酸凸起”結(jié)構(gòu)基序在讀碼器結(jié)構(gòu)域ENL YEATS中具有抑制異常相分離進(jìn)而防止癌癥發(fā)生的作用。在這項(xiàng)剛發(fā)表的研究工作中，李海濤和萬(wàn)里玲研究團(tuán)隊(duì)通力合作，深入探討了YEATS熱點(diǎn)突變導(dǎo)致ENL在靶基因上異常富集的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和相變機(jī)制。
腎母細(xì)胞瘤中，代表性ENL致癌突變（oncogenic mutation）（T1-T8）集中在YEATS結(jié)構(gòu)域的β8折疊股（β8 strand）一端。且根據(jù)突變類(lèi)型，可以分為插入型（T1、T4、T7、T8）和缺失型（T2、T3、T5、T6）兩大類(lèi)。為了闡明突變帶來(lái)的結(jié)構(gòu)變化，作者解析了4個(gè)突變體的YEATS結(jié)構(gòu)域與H3K27ac多肽的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（插入型：T1和T4；缺失型：T2和T3）。結(jié)果顯示，突變體整體結(jié)構(gòu)與野生型相比基本一致，突變的產(chǎn)生并沒(méi)有破壞YEATS結(jié)構(gòu)域的折疊，且保留了組蛋白乙酰化的識(shí)別能力。那么這些致癌突變體的共性特征是什么呢？經(jīng)過(guò)基于結(jié)構(gòu)的深入分析，研究人員發(fā)現(xiàn)上述一系列插入或刪除的突變均導(dǎo)致：b8折疊股（b8-strand）末端“脯氨酸凸起”（PP-bulge）結(jié)構(gòu)基序（motif）的消除。在野生型YEATS結(jié)構(gòu)域中，β8折疊股氨基末端存在一類(lèi)串聯(lián)脯氨酸“PP”基序，該基序被大量氫鍵網(wǎng)絡(luò)所穩(wěn)定形成一個(gè)凸起結(jié)構(gòu)，封閉和保護(hù)了β8折疊股末端。在突變體YEATS中，這個(gè)凸起結(jié)構(gòu)或被移走（插入突變）或消除（缺失突變），從而造成了β8折疊股的延伸和暴露。晶體堆積提示，延伸后的β8可以利用其暴露出的β-邊沿（β-edge）介導(dǎo)YEATS結(jié)構(gòu)域之間的“β-β”片層堆垛，進(jìn)而增強(qiáng)了原本微弱的YEATS之間的自聚集。而野生型中的“脯氨酸凸起”結(jié)構(gòu)基序則與這種互作不兼容，抑制了自聚集發(fā)生。
圖1.致癌突變體導(dǎo)致“脯氨酸凸起”移走/消除，促進(jìn)異常相分離發(fā)生。A)野生型蛋白中，YEATS結(jié)構(gòu)域β8末端的脯氨酸被大量氫鍵網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定，形成“凸起”，該結(jié)構(gòu)在突變體中被移走或消除。B)突變體利用其延長(zhǎng)的β8增強(qiáng)YEATS結(jié)構(gòu)域自聚集。C)野生型YEATS中的“脯氨酸凸起”抑制了自聚集
那么這些致癌突變的功能后果是什么呢？為了回答這個(gè)問(wèn)題，研究人員在腎細(xì)胞系中表達(dá)了與內(nèi)源水平相近的野生型和突變型Flag-ENL。在內(nèi)源表達(dá)水平下，ENL突變體（T1-T8）可以形成亞微米級(jí)（~400 nm）的凝聚體，而且這些凝聚體與靶基因（e.g., HOXA11/13）的新生RNA共定位。與野生型相比，腫瘤突變?cè)黾恿薊NL在靶基因處的富集并增強(qiáng)了其轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。有趣的是，研究人員在β8末端重新引入一個(gè)脯氨酸，從而在突變體YEATS中重構(gòu)了“脯氨酸凸起”障礙。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)這一微小突變幾乎徹底消除了腫瘤突變引起的凝聚體以及靶基因過(guò)表達(dá)。這些結(jié)果首次表明蛋白“有序”結(jié)構(gòu)域的癌癥突變可以誘導(dǎo)異常凝聚體在體內(nèi)形成，并揭示出ENL YEATS的“脯氨酸凸起”結(jié)構(gòu)基序在抑制癌癥發(fā)生中的重要作用。
圖2.單點(diǎn)突變重構(gòu)“障礙”，逆轉(zhuǎn)致癌突變體功能。A，B)致癌突變體上引入單點(diǎn)突變（β8末端組氨酸替換為脯氨酸）恢復(fù)了被延長(zhǎng)的β8，并重構(gòu)了“脯氨酸凸起”障礙。C，D)引入的脯氨酸突變?cè)隗w內(nèi)體外均有效抑制了致癌突變導(dǎo)致的異常凝聚體形成。E)并減少了其在靶基因上的聚集，抑制靶基因過(guò)表達(dá)
相分離往往由多價(jià)相互作用所介導(dǎo)，涉及到復(fù)雜而精細(xì)的分子機(jī)制。通過(guò)構(gòu)建一系列的截短體，研究者發(fā)現(xiàn)除了氨基端YEATS結(jié)構(gòu)域，ENL蛋白的其他區(qū)域，包括中間的內(nèi)在無(wú)序區(qū)（IDR）和羧基段的AHD結(jié)構(gòu)域，對(duì)凝聚體的形成也很重要。目前已知很多蛋白的相分離依賴(lài)于IDR。ENL的IDR中富含絲氨酸，且根據(jù)氨基酸電荷屬性，可以被分成富含正電荷的IDR1和富含負(fù)電荷的IDR2。根據(jù)這些特征，通過(guò)構(gòu)建多個(gè)IDR1/2截短體以及電荷和絲氨酸的突變體。研究人員揭示了IDR1和IDR2在凝聚體形成中發(fā)揮著不同但互補(bǔ)的作用：IDR1調(diào)控凝聚體的初始形成， 而IDR2調(diào)控凝聚體的大小。更重要的是，針對(duì)IDR特征設(shè)計(jì)的一系列突變減弱了凝聚體的形成頻率或大小，同時(shí)也抑制了腫瘤突變引起的異常轉(zhuǎn)錄功能。這些發(fā)現(xiàn)再次證實(shí)了異常轉(zhuǎn)錄凝聚體與功能之間的因果關(guān)系。
圖3.ENL突變體多區(qū)域協(xié)同互作促進(jìn)異常凝聚物形成，從而導(dǎo)致癌癥發(fā)生
此外，ENL通過(guò)其AHD區(qū)域與多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（SEC，DOT1L等）相互作用并參與轉(zhuǎn)錄延伸。研究人員通過(guò)細(xì)胞成像技術(shù)和ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過(guò)凝聚體形成，ENL癌癥突變可以導(dǎo)致大量調(diào)控因子富集在靶基因上。同時(shí)，通過(guò)構(gòu)建一系列AHD點(diǎn)突變，作者發(fā)現(xiàn)打破ENL與SEC/DOT1L的相互作用顯著減弱了凝聚體的形成并且抑制了下游靶基因轉(zhuǎn)錄延伸。這些發(fā)現(xiàn)表明在內(nèi)源表達(dá)水平下，ENL突變體與其他調(diào)控因子的互作對(duì)凝聚體在靶基因上的形成也很重要。
值得一提的是，目前大部分有關(guān)凝聚體形成機(jī)制及其功能的研究都基于體外或者細(xì)胞內(nèi)蛋白過(guò)表達(dá)系統(tǒng)，因此無(wú)法嚴(yán)謹(jǐn)?shù)貙⒛垠w和靶基因的轉(zhuǎn)錄直接聯(lián)系起來(lái)。作者發(fā)現(xiàn)，不同于擬生理?xiàng)l件，在過(guò)度表達(dá)情況下，ENL腫瘤突變體可以形成更大的液滴狀凝聚體。然而，兩種表達(dá)條件下形成的凝聚體的特征卻顯著不同：后者高度動(dòng)態(tài)并且不依賴(lài)于與其他調(diào)控因子的互作。而且在過(guò)表達(dá)條件下，大的液滴狀凝聚體不但不與靶基因共定位，并且可以抑制凝聚體在靶基因上的形成，從而抑制了腫瘤突變引起的靶基因過(guò)度表達(dá)。這些研究表明在不同的蛋白表達(dá)水平條件下，凝聚體形成的分子機(jī)制，其屬性特征，以及功能都有可能不同。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了在近內(nèi)源表達(dá)條件下研究凝聚體機(jī)制和功能的必要性，為這個(gè)領(lǐng)域的研究方法提出了警鐘和啟示，也為控制致病凝聚體提供了新思路。
賓夕法尼亞大學(xué)博士后宋樂(lè)樂(lè)、清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院2020級(jí)博士生姚欣儀為本文并列第一作者。賓夕法尼亞大學(xué)萬(wàn)里玲助理教授、清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院李海濤教授和李元元博士為本文共同通訊作者。本工作得到了國(guó)家蛋白研究中心（上海）、清華大學(xué)細(xì)胞影像平臺(tái)以及清華大學(xué)X-ray晶體學(xué)平臺(tái)的大力支持與幫助。
論文鏈接：
https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(22)00955-8
供稿：醫(yī)學(xué)院
題圖設(shè)計(jì)：金婭辰
編輯：李華山
審核：郭玲
